Tesis doctoral de Susana Díaz González
Haloferax mediterranei es un organismo halófilo extremo perteneciente al dominio archaea y que presenta diferentes actividades glutamato deshidrogenasa, enzima que cataliza la interconversión entre catabolitos tan importantes como el 2-oxoglutarato y el l-glutamato. Una de ellas, la nadp-dependiente, presenta un máximo de actividad a 2 m de nacl y 1 m de kcl, siendo ligeramente mayor en presencia de kcl que en nacl. También se ha determinado actividad glutamato deshidrogenasa nad-dependiente, con la que se han realizado estudios de purificación y caracterización, así como el clonaje, secuenciación y expresión de su gen. Con la finalidad de obtener enzima en concentraciones elevadas que permitiesen realizar estudios de cristalización, el gen de la nad-glutamato deshidrogenasa de hfx. Mediterranei, se expresó en el huésped mesófilo e. Coli, obteniéndose la proteína en forma de agregados insolubles. La renaturalización de la nad-glutamato deshidrogenasa recombinante se llevó a cabo mediante dilución rápida empleando tampones con una elevada concentración de sal, siendo ésta óptima a 4 m de nacl. Se purificó y caracterizó la nad-glutamato deshidrogenasa nativa observando que las propiedades moleculares y cinéticas determinadas para esta enzima son prácticamente idénticas a las obtenidas para la enzima recombinante. La nad-glutamato deshidrogenasa de hfx. Mediterranei, es un homohexámero con un tamaño de subunidad de aproximadamente 48 kda y una masa molecular de 290 kda. La enzima presenta un comportamiento halofílico y también cierto carácter termofílico, con un máximo de actividad a 4 m de nacl y una temperatura óptima de 60 ºc. Además el análisis peptídico realizado mediante la técnica de nanoelectrospray lc/ms, permite la confirmación de forma inequívoca de la identidad de la enzima nativa con la enzima obtenida mediante clonaje, secuenciación y expresión.El análisis comparativo
Datos académicos de la tesis doctoral «Nad-glutamato deshidrogenasa de haloferax mediterranei: clonaje, secuenciación y expresión. purificación y propiedades de la enzima nativa y recombinante.«
- Título de la tesis: Nad-glutamato deshidrogenasa de haloferax mediterranei: clonaje, secuenciación y expresión. purificación y propiedades de la enzima nativa y recombinante.
- Autor: Susana Díaz González
- Universidad: Alicante
- Fecha de lectura de la tesis: 19/11/2004
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María José Bonete Pérez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Juan Luis Serra ferrer
- arturo Manjon rubio (vocal)
- José Antonio Ferragut rodriguez (vocal)
- Mª dolores Arriaga giner (vocal)