Tesis doctoral de Alicia Cabezas Martin
Recientemente se publicó la primera descripción de una fad-amp liasa o fmn ciclasa, una preparación parcialmente purificada a partir de higado de rata (fraiz fj,pinto rm, costas mj, avalos m, canales j, cabezas a, cameselle jc, biochem. J. 330,881-888,1998). El principal objetivo de esta tesis doctoral era purificar esta fmn ciclasa hasta un grado de homogeneidad aparente y emplear la preparacion de alta pureza para confirmar y ampliar la caracterización de la enzima parcialmente purificada. Los pasos de purificacion fueron: obtención de un sobrenadante de 100000 g a partir de homogeneizados de higado de rata en medio isotónico, precipitación fraccionada con sulfato amónico, cromatografias de filtración en gel, intercambio ionico, afinidad por verde reactivo 19-agarosa y afinidad por adp-agarosa. La adsorción a adp-agarosa se consiguió en presencia de mn2+ (cation activador de la enzima), condición en que la fmn ciclasa permanecia adherida incluso a alta fuerza iónica, recuperandose con baja fuerza iónica sin mn2+. Los resultados de la purificación completa fueron: actividad especifica, 2,2 u/mg,purificación de 240 veces y rendimiento del 15%. Por electroforesis en condiciones desnaturalizantes revelada con plata, solo se observó una banda proteica de 59 kda. La correspondencia de la proteina con la actividad fmn ciclasa se puso de manifiesto por electroforesis desnaturalizante seguida de renaturalización, ultracentrifugación en gradiente seguida de analisis por electroforesis desnaturalizante, y electroforesis no desnaturalizante con revelado de la actividad fmn ciclasa por fluorescencia. La masa molecular nativa de la fmn ciclasa resultó ser 100 kda ó 140 kda al medirla por ultracentrifugación en gradiente o por cromatografia de filtracion en gel, respectivamente. los estudios de especificidad de sustrato y reaccion indicaron que la enzima tiene actividad liasa(ciclante) sobre los siguientes sustratos: fad(mejor sust
Datos académicos de la tesis doctoral «Purificacion y caracterizacion de la fad-amp liasa (ciclante) o fmn ciclasa de higado de rata«
- Título de la tesis: Purificacion y caracterizacion de la fad-amp liasa (ciclante) o fmn ciclasa de higado de rata
- Autor: Alicia Cabezas Martin
- Universidad: Extremadura
- Fecha de lectura de la tesis: 13/03/2001
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- José Carlos Cameselle Viña
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Antonio Sillero repullo
- cipriano Hurtado manzano (vocal)
- claudi Cuchillo foix (vocal)
- Meireles da silva goncalves ribeiro joao nuno (vocal)