Tesis doctoral de Veronica Patricia Irazusta
El hierro juega un papel esencial en el metabolismo debido a su gran versatilidad como catalizador biológico, sin embargo, su acumulación ha sido asociada con diversas condiciones patológicas como por ejemplo la ataxia de friedreich. Esta enfermedad humana está causada por la disminución de la expresión de una proteína mitocondrial denominada frataxina. Un gran número de estudios utilizando diferentes modelos, relacionan a frataxina con el metabolismo de hierro ya que su deficiencia provoca la sobrecarga de este metal. La función precisa de la proteína es motivo de controversia. La mayoría de investigadores la consideran necesaria para la biosíntesis de los centros fe-s ya que en su ausencia las actividades de enzimas con centros fe-s se encuentran disminuidas. muchos de los estudios realizados con el fin de conocer la función de frataxina han sido llevados a cabo en la levadura saccharomyces cerevisiae, ya que frataxina y su homólogo en levadura yfh1 son ortólogos. como punto de partida de esta tesis, nos planteamos el estudio del proteoma del mutante dyfh1 en levadura como modelo de la ataxia de friedreich. La estrategia utilizada se basó en el uso de electroforesis bidimensional y posterior identificación de proteínas diferencialmente expresadas en mutantes dyfh1 mediante huella de masas peptídicas. Este análisis proteómico, nos reveló que dichas células presentan un incremento en la cantidad de proteínas involucradas en la respuesta a estrés oxidativo. Entre las enzimas inducidas encontramos a las superóxido dismutasas 1 y 2, las cuales, sin embargo, mostraron menor actividad que la encontrada en las células control. Para el caso de la superóxido dismutasa dependiente de manganeso (mn-sod), este hecho paradójico era debido a una deficiencia en este metal, ya que al suplementar el medio de cultivo con manganeso, fueron restaurados tanto su contenido celular como la actividad mn-sod. Las actividades enzimáticas de cuatro proteínas que contienen centros fe-s fueron analizadas, antes y después de la suplementación del medio de cultivo con manganeso. Las actividades de tres de ellas fueron restauradas, lo que indica que frataxina no és esencial para la biosíntesis de centros fes. La cuarta proteína analizada, aconitasa, no recuperaba su actividad. el segundo objetivo fue realizar el análisis del daño oxidativo a proteínas -también referido como oxiproteoma- de las células deficientes en yfh1. La toxicidad del hierro está relacionada con su capacidad para generar especies reactivas del oxígeno (ros), las cuales tienen el potencial para dañar los componentes celulares. Mediante inmunodetección de grupos carbonilo identificamos 14 proteínas selectivamente oxidadas, la mayoría de las cuales presentaban unión a magnesio, ya sea directamente unido por ellas, o por medio de nucleótidos unidos a dichas proteínas. estudios in vitro mostraron que la oxidación de estas proteínas puede ser prevenida por magnesio e incrementada por atp. Además, el hierro quelable mostró ser siete veces mayor en las células de la cepa dyfh1 y su disminución mediante un agente quelante, logró prevenir la inactivación de las enzimas magnesio- dependientes. Una de las proteínas oxidadas fue la superóxido dismutasa 1 dependiente de cuzn (cuzn-sod), la cual mostraba niveles elevados de proteína pero se encontraba parcialmente inactivada. la relación entre la baja actividad sod, el elevado contenido en hierro quelable y la oxidación de proteínas fue estudiado con más detalle. mediante la adición de cobre y manganeso al medio de cultivo, se logró prevenir el daño oxidativo específico a las proteínas así como su inactivación. Asimismo, el mutante deficiente en sod1 presentó elevados niveles de hierro quelable e inactivación de enzimas de unión a magnesio. estos hechos en su conjunto indican que la falta de actividad sod sería la responsable de que los altos niveles de hierro puedan producir el daño oxidativo a las proteínas en las células dyfh1. por último, desarrollamos un modelo celular humano de ataxia de friedreich utilizando la línea sh-sy5y diferenciada a fenotipo neuronal. Tras la depleción de frataxina en dicho modelo mediante rna de interferencia, encontramos la inducción de ambas superóxido dismutasas y la disminución en la actividad cuzn-sod. Estos datos refuerzan la hipótesis de que las alteraciones en la actividad de las superóxido dismutasas pueden jugar un papel relevante en el desarrollo de la ataxia de friedreich.
Datos académicos de la tesis doctoral «Modificaciones del proteoma en modelos celulares de ataxia de friedreich y su relacion con el estres oxidativo y la homeostasis del hierro«
- Título de la tesis: Modificaciones del proteoma en modelos celulares de ataxia de friedreich y su relacion con el estres oxidativo y la homeostasis del hierro
- Autor: Veronica Patricia Irazusta
- Universidad: Lleida
- Fecha de lectura de la tesis: 23/07/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Jordi Tamarit Sumalla
- Tribunal
- Presidente del tribunal: francesc Palau martínez
- pedro Juan Echave lozano (vocal)
- Elena Hidalgo hernando (vocal)
- rosa María Soler tatché (vocal)