Tesis doctoral de Cristina De Castro Cristiano
Los microorganismos son modelos ideales para estudiar diferentes aspectos de la respuesta a un estrés a nivel molecular y celular; no obstante, el estudio en eucariotas se ha centrado en células de mamífero y levaduras, existiendo mucha menor información en relación con hongos filamentosos. Phycomyces blakesleeanus es un hongo filamentoso aerobio estricto que produce ácido gálico, beta-caroteno, d-eritroascorbato (deaa), un análogo de 5 átomos de carbono del ácido ascórbico, y una forma glucosilada del mismo, d-eritroascorbato glucosilado (d-eaag). Todas estas moléculas poseen actividad antioxidante. los objetivos planteados en este trabajo fueron: i) analizar la respuesta de p. blakesleeanus al estrés oxidativo generado por h2o2, ii) establecer la existencia de una respuesta común a estrés, por medio del análisis, en presencia de acetato y en condiciones de ausencia de la fuente de carbono, de las enzimas y moléculas determinadas en el estrés oxidativo y iii) análisis del proteoma de p. Blakesleeanus en condiciones de estrés por h2o2. los resultados obtenidos muestran que, cuando p. Blakesleeanus se cultiva con glucosa, existe una fuerte correlación positiva entre el contenido en fenoles totales, la capacidad antioxidante frap y el contenido en ácido gálico, por lo que este compuesto debe contribuir al potencial antioxidante del hongo. En cultivos en acetato, en donde no se detecta ácido gálico, la correlación, que sigue siendo positiva, es menos fuerte. cualquiera de los tres métodos empleados en la determinación de la capacidad antioxidante de p. Blakesleeanus, frap, abts y dpph, muestran un poder predictivo similar. En cultivos con glucosa o acetato, los contenidos más elevados de gssg, gsh o d-eaa se obtuvieron en fase de crecimiento exponencial, mientras que los de deaag y beta-caroteno se obtuvieron en fase estacionaria. El ácido gálico, d-eaa y deaag presentaron una capacidad antioxidante superior a la de cualquiera de los antioxidantes sintéticos analizados y mayor que muchos de los compuestos naturales ensayados. Existe una correlación positiva entre la capacidad antioxidante, para el deaag, ácido gálico y gsh, calculada a partir de las concentraciones intracelulares, y la capacidad antioxidante de p. Blakesleeanus cultivado con glucosa. La actividad catalasa (cat) sólo está presente en la fase de crecimiento exponencial cuando p. Blakesleeanus se cultiva con glucosa, mientras que la actividad sod y de las enzimas relacionadas con el metabolismo del glutatión, glutatión peroxidasa (gpx), glutatión transferasa (gst), glutatión reductasa (gr) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (g6pdh) o con la síntesis del d-eaa, d-arabinosa deshidrogenasa (adh) y d-arabinono-1,4-lactona deshidrogenasa (aldh) mostraron su actividad máxima en fase estacionaria. p. Blakesleeanus muestra una alta resistencia al estrés oxidativo generado por h2o2, es capaz de sobrevivir a la exposición durante 60 min a h2o2 200 mm, mostrando una viabilidad mayor en fase de crecimiento exponencial que en fase estacionaria. La resistencia de p. Blakesleeanus al estrés oxidativo parece depender de la presencia de cat, sod, unos niveles altos de gsh y de un estado reductor intracelular alto. Las actividades gpx y gst pueden desempeñar un papel más importante en fase estacionaria, ya que en ausencia de cat son las únicas actividades que pueden destoxificar el h2o2. La presencia de metabolitos secundarios, tales como el ácido gálico y d-eaag pueden tener también un papel antioxidante, sobre todo en fase estacionaria. El efecto del estrés oxidativo, medido por la intensidad de carbonilación de proteínas, es muy acusado en la fase de crecimiento exponencial y dado que no se detecta disminución en las actividades gpx, gst, gr, g6pdh, cat y sod, estas enzimas no deben estar carboniladas. En fase estacionaria, p. Blakesleeanus muestra un grado de carbonilación que no se incrementa por la exposición al h2o2, lo que indica una relación entre la carbonilación de proteínas y el envejecimiento celular, como se ha descrito para muchos sistemas biológicos. la menor viabilidad de cultivos de p. Blakesleeanus en acetato, una fuente pobre de carbono, indican que, probablemente, existe un efecto estresante del ión acetato que se acumula intracelularmente. Todas las actividades enzimáticas analizadas, gpx, gst, gr, g6pdh, cat y sod, responden de manera diferencial al crecimiento en acetato respecto al de glucosa, lo cual es especialmente notable en las actividades gpx, cat y sod, siendo la primera 10 veces superior a la registrada en glucosa, la cat que no se detecta en fase estacionaria en glucosa y la sod que muestra niveles 10 veces inferiores a los de glucosa. El valor del cociente gsh/gssg es 50 veces superior al obtenido en el cultivo con glucosa, lo que indicaría un nivel intracelular reductor mayor, también es de destacar los niveles más elevados de beta-caroteno y trehalosa. la respuesta de p. Blakesleeanus a la privación de la fuente de carbono se podría considerar, de forma global, como una respuesta similar al estrés oxidativo generado por h2o2: presencia de cat, niveles altos de sod, alto cociente gsh/gssg, aunque en este caso, de menor magnitud, como queda reflejado en una menor relación sod/cat, menor cociente gsh/gssg y el mantenimiento de d-eaag. Estos resultados confirman la idea general asociada a la respuesta adaptativa al estrés por privación de la fuente de carbono que conduce a un incremento en la tolerancia al estrés oxidativo en hongos, que implica la inducción de elementos dependientes de gsh del sistema de defensa antioxidante. El glucógeno y la trehalosa, almacenados en p. Blakesleeanus cuando es cultivado con glucosa, podrían contribuir al mantenimiento de unas condiciones adecuadas en el hongo, que permitan su supervivencia, cuando se le somete a la privación de la fuente de carbono. un estado intracelular reductor y una actividad catalasa están implicados en la respuesta de p. Blakesleeanus a los tres tipos de estrés, si bien, en el estrés por acetato y por la privación de la fuente de carbono debe estar inducida una forma isoenzimática de la cat, que se expresa en respuesta a la ausencia de glucosa. No obstante, el análisis global de las moléculas estudiadas no permite establecer una respuesta común de p. blakesleeanus al estrés oxidativo por h2o2, por acetato y por la privación de la fuente de carbono. se llevó a cabo una optimización del protocolo de extracción, solubilización y precipitación de las proteínas a partir de micelio de p. Blakesleeanus, así como del proceso de separación de proteínas por electroforesis bidimensional, con objeto de obtener el mapa bidimensional de proteínas intracelulares del hongo, que nos permitiera establecer la existencia de cambios proteómicos generados por el estrés oxidativo. De forma global, tanto en el control como en el estrés por h2o2, el mayor número de manchas proteicas se observan en la zona del punto isoeléctrico correspondiente al intervalo de ph neutro-ligeramente básico y con masas moleculares comprendidas entre 31 y 66 kda. El estrés oxidativo produce una expresión diferencial de proteínas, incrementando la oxidación reversible de grupos tioles proteicos. Mediante espectrofotometría de masas se identificó el factor de elongación de la traducción 1-alfa de p. Blakesleeanus, que presumiblemente debe contener cisteína/s oxidadas reversiblemente. El procesamiento definitivo de los resultados obtenidos de este análisis proteómico, así como la obtención de nuevos resultados deberá conducirnos a la identificación de proteínas que respondan al estrés oxidativo por h2o2, lo que se podrá conseguir cuando esté disponible el genoma de p. Blakesleeanus.
Datos académicos de la tesis doctoral «Respuesta antioxidante de phycomyces blakesleeanus en condiciones de estrés. función del d-eritroascorbato«
- Título de la tesis: Respuesta antioxidante de phycomyces blakesleeanus en condiciones de estrés. función del d-eritroascorbato
- Autor: Cristina De Castro Cristiano
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 15/07/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Mª Dolores Arriaga Giner
- Tribunal
- Presidente del tribunal: arturo Pérez eslava
- José Antonio Barcena ruiz (vocal)
- angel Reglero chillon (vocal)
- mercedes Renobales scheifler (vocal)