Tesis doctoral de Sonia Martínez Martínez
La enfermedad de glí¤sser, causada por hemophilus parasuis, ha ido adquiriendo importancia en los últimos años debido a las pérdidas económicas que supone en el sector porcino. Su patogenia e interacción con el sistema inmune presentan aún muchos aspectos desconocidos, lo que impide el avance de las estrategias de prevención y control de la enfermedad. basándonos en trabajos anteriores llevados a cabo en nuestro laboratorio, se centró este estudio en las proteínas de h. Parasuis relacionadas con la captación del hierro, ya que en otros microorganismos próximos filogenéticamente estas proteínas han desarrollado una buena respuesta inmune. Debido a que nuestro grupo de investigación ya había expresado la proteína recombinante tbpb del serotipo 5 de h. Parasuis con fines vacunales, se diseño y produjo ahora una proteína recombinante tbpa. Ensayada su capacidad de producir inmunogenicidad en animales de experimentación, los resultados fueron favorables en conejos. se reprodujo también la enfermedad en un modelo experimental basado en el hospedador natural. Se recurrió para ello a cerdos privados de calostro que desarrollaron un cuadro clínico y lesional característico de la enfermedad, lo que nos permitió estudiar la patogenia y la respuesta inmune frente a la bacteria, a la vez que la protección conferida por diversas formulaciones vacunales, entre ellas, las proteínas recombinantes tbpa y tbpb. las inmunizaciones llevadas a cabo con las proteínas recombinantes tbpa y tbpb del serotipo 5 de h. Parasuis, cepa nagasaki, proporcionaron una protección parcial, con supervivencia de tan solo algunos de los lechones inmunizados. Otro procedimiento de vacunación consistió en la utilización de un extracto proteico con afinidad por la transferrina, obtenido a partir de un protocolo de extracción de proteínas de h. Parasuis en condiciones restrictivas de hierro y su posterior purificación a través de una columna de afinidad por la transferrina. Este extracto proteico fue inoculado en dos lotes experimentales diferentes: en un caso por vía intramuscular y en el otro, por vía intratraqueal. En ambos casos confirieron una protección total frente a la infección por la bacteria, con supervivencia de todos los animales sin presentar las lesiones típicas de la enfermedad. Se utilizó también, un grupo experimental al que se le administró una vacuna comercial inctivada basada en el serotipo 5 de h. Parasuis. La protección resultó igualmente total. Por último, se mantuvo un grupo control, que no fue inmunizado, a fin de confirmar que la dosis de infección era la correcta para el desarrollo normal de la enfermedad. Estos animales murieron como consecuencia de un proceso septicémico agudo, tal y como se dedujo del estudio de los síntomas clínicos y de las lesiones anamopatológicas. todos los antígenos seleccionados para la prueba experimental fueron preparados con el mismo adyuvante (montanide ims 2215 vg pr), excepto las proteínas de unión a la transferrina administradas por vía intratraqueal, que se potenciaron con la neuraminidasa tipo vi® de c. Perfringens. Después del desafío, sólo se pudo recuperar la bacteria a partir de los animales que murieron. Fueron los animales control, no inmunizados pero infectados, los que presentaron una distribución de la bacteria más amplia, mientras que h. Parasuis no pudo ser aislado de ninguna de las localizaciones muestreadas en los animales vacunados con el extracto proteico nativo de unión a la transferrina o con la bacterina comercial. antes de llevar a cabo la infección, se estudió la actividad bactericida de los sueros de los diferentes grupos experimentales. Se observó cómo en todos los animales vacunados se producían anticuerpos tras la primera inmunización, que conferían actividad bactericida. Se puso además de manifiesto la necesidad del complemento en los sueros de los animales para llevar a cabo la actividad bactericida. se estudió asímismo la respuesta de fase aguda valorando para ello los niveles de pig-map, haptoglobina, proteína c reactiva y apolipoproteína a-i, desde el momento de la infección hasta la muerte o sacrificio de los animales. Se observó claramente que los animales que murieron tras la infección, los cerdos control y algunos de los inmunizados con las proteínas recombinantes presentaban unas variaciones estadísticamente significativas desde el momento de la infección, en todas las proteínas de fase aguda valoradas. Los valores máximos coincidieron, en la mayoría de los casos, con el momento previo a la muerte. Los animales que sobrevivieron, independientemente de la inmunización recibida, no presentaron variaciones significativas en sus proteínas de fase aguda hasta el momento del sacrificio. el estudio de respuesta humoral reveló que todos los animales inmunizados producían anticuerpos frente a las igg totales, igg1, igg2 y igm tras la primera inmunización. Los grupos parcialmente protegidos mostraron unos valores de anticuerpos inferior al de los lotes con protección total en todas y cada una de las inmunoglobulinas estudiadas. En los grupos parcialmente protegidos y en el inmunizado con la vacuna comercial, se detectó mayores niveles de anticuerpos en todas las inmunoglobulinas, en los elisas tapizados con la bacteria inactivada. En cambio, en los inmunizados con las proteínas de unión a las transferrina, los valores de densidad óptica más elevados se obtuvieron en los elisas tapizados con dichas proteínas. En el grupo control, cuyos animales murieron rapidamente tras la infección, sólo se pudo estudiar la respuesta humoral hasta el momento del desafío. Estos animales no presentaron en ningún momento seroconversión frente a los antígenos de h. Parasuis. en el caso concreto de la iga, la cinética de sus valores dependió claramente del tipo de inmunización recibida. No se produjo anticuerpos en ningún grupo experimental, excepto en el inmunizado con las proteínas de unión a la transferrina por vía intratraqueal, en donde el principal aumento ya se detectaba tras la primera inmunización y estos valores continuaban aumentando hasta el momento del desafío. Estos datos revelan cómo las musosas se ven estimuladas tras la inmunización intratraqueal, lo que no parrece suceder cuando las inmunizaciones se efectúan por vía intramuscular. el estudio de la respuesta humoral en los grupos en que la protección fue total determina la relación directa entre los niveles de anticuerpos y la capacidad de protección frente a la enfermedad. Sin embargo, esta relación no se cumplió en los animales inmunizados con las proteínas recombinantes, ya que los animales que no sobrevivían a la infección presentaban valores aceptables en la producción de anticuerpos, lo que significa que, o bien estos anticuerpos producidos no resultaban suficientes, o no eran específicos para la protección frente a h. Parasuis. cuando se llevó a cabo la identificación de las proteínas que formaban parte del extracto proteico con afinidad por la transferrina, se obtuvieron varias de las esperadas, como la tbpa o la tbpb, así como otras proteínas relacionadas con la captación y el transporte del hierro interesantes como candidatos antigénicos y finalmente, algunas proteínas cuya función no se pudo relacionar con este elemento químico. al realizar la inmunoproteómica con los grupos que habían obtenido la protección total, se comprobó cómo las proteínas de las que se podía esperar una buena respuesta inmune, como la tbpa o la tbpb, no eran capaces de desarrollarla. En cambio, otras que en el extracto proteico presentaban unas concentraciones escasas podían producir una respuesta inmune intensa, como sucedió con el transportados abc o con la proteína de membrana externa omp2. En el grupo inmunizado con el extracto proteico de unión a la transferrina por vía intratraqueal fue en el que se obtuvo una respuesta inmune más intensa y frente a un mayor número de proteínas. En el grupo inmunizado con la vacuna comercial, su respuesta resultó muy parecida a la de los cerdos vacunados con las proteínas de unión a la transferrina. Por tanto, ambos preparados presentaron unos resultados de inmunidad similares, con la ventaja de que nuestro antígeno sólo integraba un subproteoma de h. Parasuis y no la bacteria entera inactivada. queda demostrada la importancia de las proteínas de unión a la transferrina en la protección frente a la infección por h. Parasuis, pudiéndose encontrar entre ellas algunos candidatos vacunales eficaces frente a la enfermedad de glí¤sser. Se pone de manifiesto también cómo las inmunizaciones intratraqueales pueden suponer una nueva vía alternativa de protección frente a esta enfermedad.
Datos académicos de la tesis doctoral «Respuesta de fase aguda y estudio de la inmunidad humoral en cerdos vacunados con diferentes formulaciones frente a haemophilus parasuis«
- Título de la tesis: Respuesta de fase aguda y estudio de la inmunidad humoral en cerdos vacunados con diferentes formulaciones frente a haemophilus parasuis
- Autor: Sonia Martínez Martínez
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 26/01/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Cesar Bernardo Gutierrez Martín
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Santiago Vadillo machota
- María rosa Caro vergara (vocal)
- oscar r. González llamazares (vocal)
- monica Suarez rodriguez (vocal)