Tesis doctoral de Begoña Anguita Bustamante
En nuestro laboratorio siempre ha trabajado con la finalidad de conseguir el máximo número de blastocistos posibles a partir de ovocitos recuperados de cabras prepúberes sacrificadas en matadero. La población ovocitaria recuperada de estas hembras suele ser muy variable, debido básicamente a factores fisiológicos. Por este motivo, los ovocitos deben seleccionarse cuidadosamente con el fin de utilizar en el procedimiento de producción in vitro de embriones solo aquellos capaces de madurar in vitro, se fecundados y mantener el desarrollo embrionario. Hasta el momento, la selección realizada en nuestro laboratorio se basaba en criterios morfológicos, seleccionando solo los ovocitos rodeados de varias capas compactas de células del cumulus y citoplasma homogéneo, y de gran tamaño. Sin embargo, el porcentaje de blastocistos obtenidos utilizando los ovocitos seleccionados siguiendo estos criterios ha sido bajo, y no se ha conseguido superar el 10% (izquierdo et al 1999). Esta tesis, por lo tanto, nació de la necesidad de encontrar marcadores que pudieran indicarnos la competencia del ovocito, de modo que podamos distinguir los ovocitos competentes para el desarrollo del resto de ovocitos que no son capaces de desarrollarse hasta el estadio de blastocistos. los dos primeros trabajos de esta tesis, que podemos englobar dentro de un gran bloque, tiene como objetivo estudiar el papel que juegan la expresión de las subunidades del mpf (maturation promoting factor), la cíclina b1 y la p34cdc2, así como su actividad kinasa, y la acumulación de rna y proteínas en os ovocitos con la adquisición de competencia para el desarrollo. Las técnicas utilizadas para evaluar el estos parámetros son técnicas invasivas, de modo que los ovocitos analizados no pueden ser utilizados posteriormente para continuar el desarrollo embrionario. Por lo tanto, era necesario relacionar las características moleculares estudiadas con un parámetro nos permitiera seleccionar los ovocitos de forma visual. en estos trabajos el parámetro no invasivo escogido fue el diámetro ovacitario, ya que en numerosas especies se ha observado que existe una relación positiva entre la capacidad del ovocito para dar lugar a un embrión viable y el diámetro folicular (bovino: furher et al 1989; caprino: crozet et al 1995; porcino: marchal et al 2002), y éste, a su vez, se correlaciona con el diámetro ovictario (bovino:arlotto et al 1996;caprino crozet et al 200: de smedt et al 1994). De este modo, los ovocitos de cabras prepúberes recuperados de matadero fueron divididos en 4 grupos según su tamaño:<100micra m, 110-125 micra m,125-135 micra m y >135micra m (de smedt et al 1994). Estos ovocitos fueron madurados y fecundados in vitro, y los embriones resultantes fueron cultivados sin vitro para comprobar la competencia ovocitaria de cada grupo de tamaño. A su vez, se evaluó el estadio nuclear de una muestra de ovocitos de cada grupo antes y después de la miv. El estudio de expresión de las subunidades del mpf se realizó mediante rt-pcr y western blot para la p34cdc2. Además, se cuantificó la cantidad de proteínas y de rna acumulados en ovocitos de cada grupo mediante el método de lowry modificado y por espectrofotometría, respectivamente. Los resultados mostraron que en el momento de recoger los ovocitos de los folículos, la mayoría ya había reanudado la meiosis, y esta proporción era mayor a medida que aumentaba el diámetro ovocitario. Además, los ovocitos de mayor tamaño fueron los que alcanzaron mayor porcentaje de maduración nuclear tras la miv, tuvieron mayor tasa de fecundación normal, de división embrionaria a las 48 h. Post-fecundación y dieron lugar al mayor porcentaje de blastocistos. Nuestros resultados mostraron que los ovocitos de mayor diámetro, que eran los más competentes, no diferían del resto de grupos estudiados en cuanto a la expresión de arn y arnm de p34cdc2, de arnm de cíclina b1 y de proteína total antes y después de la miv; por el contrario, si observamos mayor niveles de arn total acumulado y de arn de cíclina b1 después de la miv, mayor nivel de proteína p34cdc2 y de actividad del complejo mpf. Por lo tanto, nuestros resultados indicaron que la competencia para el desarrollo estaba relacionada con el mpf, sugiriendo un posible papel de este complejo en la maduración citoplasmática. el tercer trabajo surgió a raíz de los resultados obtenidos en los primeros estudios. Nos sorprendió observar que la mayoría de ovocitos hubieran reanudado la meiosis en el momento de recuperarlos de los folículos. Los ovocitos solo reanudan en el interior de los folículos como respuesta al estimulo hormonal de la lh, previo a la ovulación, o bien debido a un proceso de degeneración o atresia. Nuestros estudios se realizan en hembras prepúberes, todavía no maduras hormonalmente, de modo que nos planteamos la posibilidad de que los ovocitos que estábamos recogiendo estuviesen sufriendo un proceso mas o menos avanzado de atresia, que posiblemente pudiera interferir en los resultados de desarrollo embrionario. La realización del tercer estudio se realizado en la universidad de gante, donde utilizaban técnicas de detección de apoptosis de modo rutinario, y se usaron ovocitos bovinos debido a la imposibilidad de disponer de ovocitos caprinos. La finalidad de este trabajo fue aprender las técnicas de tinción con annexin v y tunel mediante la realización de un estudio de apoptosis en ovocitos bovinos, células del cumulus y blastocistos según el diámetro ovocitario. Para ello, los ovocitos recuperados de matadero se clasificaron en tres grupos de tamaño:<110 micra m, 110-120 micra m y >120 micra m (fair et al 1995). Los ovocitos fueron madurados y fecundados in vitro y los embriones fueron cultivados durante 6 días más. Una muestra de ovocitos y células del cumulus fueron usados para evaluar apoptosis antes y después de la miv mediante annexin v y tunel. El resto de los ovocitos continuaron el desarrollo embrionario y los blastocistos resultantes también fueron evaluados con las mismas técnicas. En este estudio la capacidad para el desarrollo embrionario se conseguía en los ovocitos >110 micra m. Los resultados obtenidos indicaron que el porcentaje de ovocitos inmaduros que mostraban signos de apoptosis disminuía en los ovocitos >110 micra m. Además el porcentaje de ovocitos apoptóticos se redujo claramente durante la maduración in viro. Por el contrario, a apoptosis en las células del cumulus aumento con la maduración. Por ultimo, los blastocistos obtenidos mostraron menor incidencia de apoptosis en estadio tardío en los ovocitos de mayor diámetro evaluado mediante annexin v pero no mediante tunel. A partir de estos resultados llegamos a la conclusión que las diferencias de desarrollo embrionario observadas entre ovocitos de diferente tamaño no podrían ser explicados únicamente por una diferencia en la incidencia de apoptosis entre diámetros. por ultimo, el cuarto y quinto trabajo pretendía evaluar la apoptosis en ovocitos caprinos de diferentes diámetro mediante las dos técnicas utilizadas en el estudio anterior. En estos trabajos quisimos introducir un parámetro mas a tener en cuenta, además del diámetro ovocitario, y por ello clasificamos nuestros ovocitos también según criterios morfológicos en dos grupo: los que no mostraban signos de atresia, es decir, que presentaban el cumulus y compacto y el citoplasma homogéneo; y aquellos que presentaban signos de atresia temprana, es decir, con el cumulus ligeramente expandido y/o citoplasma del ovocito heterogéneo. Pensamos que era interesante introducir el parámetro de la morfología porque nos podía aportar mas información sobre el efecto de la apoptosis en el desarrollo embrionario. Para ello, los ovocitos fueron clasificados por diámetro siguiendo los criterios explicados en el primer trabajo, y por morfología según los parámetros anteriormente mencionados. Al igual que en el anterior estudio, la apoptosis fue evaluada en ovocitos y células del cumulus antes y después de la maduración, y en los blastocistos obtenidos. En estos estudios, al igual que el realizado en bovino, también observamos una disminución de la apoptosis en ovocitos y un incremento de células del cumulus durante la maduración in vitro. En general, se observo que los ovocitos de mayor diámetro y de morfología san presentaban menos incidencia de apoptosis, aunque los resultados obtenidos difieran según la técnica utilizada. No se detectaron diferencias en los blastocistos obtenidos a partir de ovocitos de diferente diámetro. Por ultimo, pudimos observar que la capacidad para el desarrollo embrionario son dependía solo del diámetro del ovocito, sino también de su morfología. Por lo tanto pudimos concluir que la apoptosis si puede influenciar la capacidad para el desarrollo del ovocito, pero no la calidad del blastocisto obtenido.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio molecular y de apoptosis en ovocitos de cabras prepuberes y su relacion con el desarrollo embrionario«
- Título de la tesis: Estudio molecular y de apoptosis en ovocitos de cabras prepuberes y su relacion con el desarrollo embrionario
- Autor: Begoña Anguita Bustamante
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 16/02/2007
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María Teresa Paramio Nieto
- Tribunal
- Presidente del tribunal: josep Santalo
- dimitrios Rizos (vocal)
- patrick Lonergan (vocal)
- olga Francino (vocal)