Tesis doctoral de Mªangeles Montes Fernández
Introducción: la transmisión sináptica se define como la transferencia de información entre células nerviosas. Este es el proceso más importante que tiene lugar en el cerebro. El procesamiento de la información neuronal requiere de unos mecanismos de señalización que deben de ser flexibles y fácilmente modificables. Este proceso de comunicación neuronal requiere de sitios especializados donde se va a producir la transmisión sináptica que se denomina sinapsis. la señalización sináptica está mediada por una gran variedad de neurotransmisores químicos que llevan una señal desde una neurona presináptica a una neurona postsináptica. Independientemente del tipo de neurotransmisor el mismo mecanismo es utilizado en todas las sinapsis. El neurotransmisor es almacenado en las vesículas sinápticas en el terminal presináptico y es liberado cuando se produce la llegada de un potencial de acción. El neurotransmisor liberado va a estimular a los receptores postsinápticos y así se completa la transmisión sináptica. La mayoría de las neuronas forman más de 500 terminales nerviosos presinápticos que están ampliamente separados de los cuerpos celulares neuronales. El potencial de acción se inicia en el cuerpo celular viaja hacia el terminal nervioso para ser transformado en la señal secretora sináptica. No todos los potenciales de acción se convierten en una señal secretora (ygoda & sudhof, 1997). En la mayoría de los terminales sólo 10%-20% de los potenciales de acción producen la liberación. según la hipótesis de del castillo y katz en 1954 de cómo se produce la transmisión sináptica debemos de considerar el mecanismo por el que se liberan las sustancias transmisoras. A pesar de que la liberación del transmisor sináptico parece uniformemente graduada realmente el transmisor se libera en cantidades discretas denominadas cuantos. Cada cuanto de transmisor produce un potencial sináptico de tamaño fijo denominado potencial sináptico cuántico. El potencial postsináptico total está constituido por un número integral de respuestas cuánticas. Los potenciales sinápticos aparecen como una escala uniformemente graduada en los registros porque cada potencial cuántico es demasiado pequeño en relación con el potencial total. figura 1. Imagen tomada del artículo (del castillo & katz, 1954). A. Fluctuaciones del potencial de placa motora de la unión neuromuscular. B. Histogramas que muestran la distribución de amplitudes de los potenciales espontáneos en miniatura y los potenciales de la placa motora. al realizar una correlación morfológica de las variables definidas por katz en el sistema nervioso central podemos deducir: a) cuanto: es la exocitosis de una única vesícula sináptica. b) sitios de liberación (n): una zona activa: el número de lugares de liberación (n) se corresponde con el número de vesículas dispuestas para liberarse o bien el número de sitios de membrana específicos que podría exocitarse tras la llegada de un potencial de acción. Varios autores han descrito que el número de lugares de liberación es muy similar al número de sinapsis (zucker, 1973), (redman, 1990) y (korn & faber, 1991). Esta observación nos lleva a la conclusión de que existen algunos mecanismos que restringen el número de vesículas que se van a fusionar por impulso nervioso en un único terminal. Algunas conexiones sinápticas poseen un gran número de zonas activas pero en la mayoría de las sinapsis sólo nos encontramos con una única zona activa. Así se sabe que en las neuronas en cultivo 11 de 16 (69%) botones poseen una única zona activa y 5 (31%) botones poseen dos zonas activas (schikorski & stevens, 1997) figura 2. Imagen tomada del artículo (schikorski & stevens, 1997). A, microscopía electrónica de varias sinapsis del estratum radiatum en ca1 en el hipocampo del ratón donde las flechas indican los bordes de las zonas activas. B y c microscopía electrónica donde se muestra la ultraestructura de dos sinapsis de neuronas de hipocampo crecidas en cultivo. c) probabilidad de liberación (p): es la probabilidad que un cuanto pueda ser liberado cuando llega un impulso nervioso. En la mayoría de las sinapsis en el cerebro poseen un valor pequeño y es variable incluso en las sinapsis presentes en un mismo axón (hessler et al., 1993), (rosenmund et al., 1993), (allen & stevens, 1994) y (murthy et al., 1997). La mayoría de las sinapsis poseen una probabilidad de liberación ~0.3 pero algunas sinapsis específicas poseen valores que oscilan entre 0.05 y 0.9 o más. Al incrementar la concentración de calcio extracelular se puede observar un incremento en la probabilidad de liberación (murthy et al., 1997). la probabilidad de liberación va a estar regulado por el tamaño del contingente de vesículas que están listas para ser liberadas (rrp) es decir está regulado por el número de vesículas ancladas en la membrana (zucker, 1973). El número de vesículas por botón es de 195 con un rango que oscila entre 23 y 648 vesículas y el número de vesículas que forman parte del rrp es de 5-10 vesículas (harris & sultan, 1995) y (schikorski & stevens, 1997). así podemos definir el rrp como la población de neurotransmisor que está inmediatamente disponible para ser liberado cuando se aplica una estimulación a alta frecuencia. El rrp va a definir la probabilidad de liberación. Además se ha propuesto que este contingente coincide con las vesículas que se encuentran ancladas en la membrana (schikorski & stevens, 2001). El tamaño del rrp ha sido estimado utilizando una solución hipertónica (stevens & tsujimoto, 1995) o bien utilizando una estimulación de 40 potenciales de acción a 20 hz en experimentos que utilizan técnicas de imagen como es el marcaje de las vesículas sinápticas utilizando los colorantes fm (schikorski & stevens, 2001). objetivos: los objetivos de esta tesis son: 1. Expresión en membrana plasmática de neuronas de hipocampo de proteínas de las vesículas sinápticas fluorescentes unidas a sensores de ph como la sinaptobrevina-fluorina y sinaptofisina-fluorina. 2. Estudio de la amplitud de la intensidad de fluorescencia de las neuronas de hipocampo utilizando un sistema de microestimulación donde inyectamos cantidades pequeñas de corriente de una magnitud de 50 µa y provocamos el disparo de distinto número de potenciales de acción. 3. Estudio de las constantes cinéticas de exocitosis y endocitosis de la respuesta de distintos tipos de estimulación. 4. Detección óptica de la señal de fluorescencia de la respuesta con un único potencial de acción. 5. Estudiar la respuesta con un único potencial para comprobar si la liberación se debe a vesículas únicas o no. 6. Ajuste de esta respuesta a una distribución binomial. 7. Estudio de colocalización de los botones sinápticos utilizando un sistema adaptado a la cámara (dualview) que nos permite separar la señal de fluorescencia en verde y en rojo. 8. Estudio de la respuesta de los mismos botones teñidos con colorantes de membrana como son fm y botones transfectados con proteínas fluorescentes sensibles a ph. material y métodos: para ello se van a utilizar neuronas de hipocampo de rata crecidas sobre una monocapa de astrocitos. Estas neuronas se van a transfectar con el método de fosfato cálcico. los plásmidos utilizados para la transfección van a ser sinaptobrevina-fluorina y sinaptofisina-fluorina. La estructura de estos plásmidos se muestra en la siguiente figura: sinaptobrevina-fluorina sinaptofisina-fluorina otra técnica utilizada para estudiar el reciclaje de las vesículas sinápticas va a ser la tinción con colorantes fm. El fm 4-64 y otros colorantes estiril han sido utilizados para monitorizar la exocitosis, endocitosis y el tráfico endosomal de una gran variedad de tipos celulares. Este colorante es una molécula anfipática y su estructura está formada por una cabeza cargada y una cola anfipática. La fluorescencia de las moléculas de fm reside en la región central de unión entre la cabeza polar y la cola anfipática. El número y longitud de estas colas hidrofóbicas va a determinar la cinética de lavado de los diferentes tipos de fm (betz et al., 1996). Este colorante tiene la propiedad de emitir fluorescencia cuando está en contacto con las membranas. n-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl) pyridinium dibromide (fm® 4-64) bibliografía: allen c & stevens cf. (1994). An evaluation of causes for unreliability of synaptic transmission. Proc natl acad sci u s a 91, 10380-10383. betz wj, mao f & smith cb. (1996). Imaging exocytosis and endocytosis. 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Datos académicos de la tesis doctoral «Monitorización óptica de la liberación de vesículas sinápticas únicas en neuronas de hipocampo en cultivo«
- Título de la tesis: Monitorización óptica de la liberación de vesículas sinápticas únicas en neuronas de hipocampo en cultivo
- Autor: Mªangeles Montes Fernández
- Universidad: Sevilla
- Fecha de lectura de la tesis: 15/10/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Guillermo Alvarez De Toledo Naranjo
- Tribunal
- Presidente del tribunal: carles Solsona sancho
- ricardo Borges jurado (vocal)
- bernat Soria escoms (vocal)
- lucía Tabares (vocal)