Tesis doctoral de María Morales Esteban
La peroxidasa versátil (vp) se caracteriza porque combina propiedades catalíticas de los otros dos tipos de peroxidasas ligninolíticas, la lignina peroxidasa (lip) y la manganeso peroxidasa (mnp). En este trabajo se describen los sitios de unión a su stratos, así como los mecanismos de acción de la vp de pleurotus eryngii. Para ello, utilizando como base la estructura de la isoenzima vpl (variante alélica vpl2), se diseñaron una serie de variantes modificadas obtenidas por mutagénesis dirigida, s eguida de su expresión en escherichia coli y activación in vitro. Las variantes estudiadas correspondieron a los distintos sitios de oxidación de sustratos: i) el hipotético sitio de oxidación del mn2 ; ii) el triptófano catalítico, sustituyéndolo po r otros residuos también capaces de formar radicales; iii) el entorno del triptófano catalítico; y iv) el canal principal de acceso al hemo, como posible sitio de oxidación de fenoles, entre otros. el estudio del sitio de oxidación del mn2 se realiz ó mediante la caracterización de variantes mutadas en los residuos homólogos a los implicados en la oxidación de este sustrato por la mnp. Los resultados cinéticos evidenciaron que el sitio de unión al mn2 de la vp está constituido por los residuos ácidos glu36, glu40 y asp175, junto con el propionato interno del hemo. Además se realizaorn estudios cristalográficos en los que se demostró que los residuos glu36 y glu40 del sitio de unión al mn2 de la vp presentan cierta movilidad, permitiendo o no el acceso al hemo. la oxidación de los compuestos aromáticos de alto potencial rédox tiene lugar a través del radical del trp164, formado gracias a una ruta de transporte electrónico de largo recorrido desde el hemo. utilizando resonancia paramag nética electrónica (epr) de baja temperatura fue posible detectar por primera vez en una peroxidasa ligninolítica dicho radical de la proteína en las dos formas intermedias del ciclo catalítico (compuestos i y ii). Se realizaron variantes en las que se sustituyó el trp164 por otros residuos susceptibles de formar radicales (his y tyr). Se comprobó que el único de estos residuos eficaz en la oxidación de los sustratos es el trp164. Sin embargo, por epr se comprobó que la variante w164y forma un r adical tirosilo, tanto en su compuesto i como en el ii, siendo el primero de ellos capaz de oxidar el alcohol veratrílico. Sin embargo, esta variante no presenta actividad catalítica en estado estacionario ni se autorreduce. Este efecto no se debe a
Datos académicos de la tesis doctoral «Caracterización de diferentes sitios de oxidación de sustratos en la peroxidasa versátil de pleurotus eryngii«
- Título de la tesis: Caracterización de diferentes sitios de oxidación de sustratos en la peroxidasa versátil de pleurotus eryngii
- Autor: María Morales Esteban
- Universidad: Complutense de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 27/03/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Francisco Javier Ruiz Dueñas
- Tribunal
- Presidente del tribunal: josé Martínez peinado
- José neptuno Rodriguez lopez (vocal)
- Miguel Alcalde galeote (vocal)
- ignacio Fita rodriguez (vocal)