Tesis doctoral de Patricia Casino Ferrando
El objetivo de este trabajo es el estudio de las bases bioquímicas y estructurales de la transducción de la señal mediada por los sistemas de dos componentes (tcs). En la última mitad de los años ochenta emergió el término dos componentes para describir una nueva clase de sistemas de transducción de señal encontrados en bacterias. En la actualidad, cientos de estos sistemas han sido descritos en eubacterias, arqueobacterias y en menor medida en eucariotas (plantas y levaduras) (nixon et al., 1986). Los sistemas de dos componentes (tcs) responden a múltiples estímulos, controlando a su vez una amplia variedad de procesos esenciales para la célula como quimostasis, ciclo celular, esporulación, relacionados con la virulencia, y la resistencia a antibióticos. El sistema prototipo consta de dos componentes centrales: una proteína histidina quinasa (hk) y una proteína reguladora de la respuesta (rr). En general, la química de la transducción de señal en un sistema básico de dos componentes incluye tres reacciones: la llegada de un estímulo modula la autofosforilación en un residuo de histidina específico de una hk dímerica, posteriormente este mismo grupo fosforilo es transferido a un aspartato del correspondiente rr, y finalmente el rr se defosforila, bien por un actividad fosfatasa intrínseca o bien inducido por la hk. El nivel de fosforilación del rr altera sus propiedades transcripcionales, enzimáticas o mecanísticas esenciales para la célula. en esta tesis se presenta el siguiente trabajo: – identificación del rr que trabaja con tm0853. Tm0853 es una hk huérfana y mediante ensayos de fosfotransferencia con varios rrs huérfanos (tm0143, tm0468, tm0842) de t. Marítima demostramos que tm0468 es el rr que forma sistema con ella. – caracterización de la estabilidad de tm0468 fosforilado. Mediante electroforesis nativa-page y utilizando el fosfodonador acetilfosfato estudiamos la vida media del rr fosforilado. También se ha estudiado de la actividad fosfatasa de tm0853 sobre tm0468. – caracterización estequiométrica del complejo formado por tm0853 y tm0468 mediante electroforesis (nativa-page y sds-page) así como mediante ultracentrifugación analítica. – cristalización y resolución de la estructura por difracción de rayos x del complejo formado por tm0853 y tm0468 utilizando la técnica de dispersión anómala a diferentes longitudes de onda (mad). Hasta el momento, es la primera estructura tridimensional de un tcs completo formado por una hk y su correspondiente rr. Esta estructura ha permitido observar los cambios conformacionales entre tm0853 en solitario y formando complejo con su correspondiente rr. – cristalización de tm0468 en solitario así como la resolución de su estructura tridimensional mediante difracción de rayos x a 2 í¥ de resolución, utilizando la técnica de reemplazo molecular. Esto nos ha permitido observar los cambios conformacionales entre tm0468 en solitario y unido a tm0853. -ambas estructuras nos han permitido definir las bases estructurales del reconocimiento entre una hk y su correspondiente rr. También nos ha permitido proponer un mecanismo para la transducción de la señal. – caracterización bioquímica de la reacción de autofosforilación de tm0853. Hemos podido comprobar que dicha reacción se realizaba de forma cis en contraste con el modo trans que se creía universal para todas las hks. – realización de ensayos de entrecruzamiento entre tm0853 y tm0468 para estudiar la reacción de autofosforilación y fosfotransferencia. La estructura del complejo nos indicaba que las conformaciones que debía adoptar la hk para realizar ambas reacciones podían ser muy similares.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio de las bases estructurales y enzimáticas del mecanismo de transducción de señal mediado por sistemas de dos componentes«
- Título de la tesis: Estudio de las bases estructurales y enzimáticas del mecanismo de transducción de señal mediado por sistemas de dos componentes
- Autor: Patricia Casino Ferrando
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 22/09/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Alberto Marina Moreno
- Tribunal
- Presidente del tribunal: vicente Rubio zamora
- Francisco Garcia del portillo (vocal)
- ignacio Fita rodriguez (vocal)
- asunción Contreras de vera (vocal)