Tesis doctoral de Rocio Coloma Ciudad
Summary 21 introducción 23 el virus de la gripe 25 1. Historia 2. Clasificación y nomenclatura 3. La partícula viral – proteínas virales 4. Rnas virales la ribonucleoproteína del virus de la gripe 29 1. La polimerasa viral – pb pb 1 – pb pb 2 – pa pa 2. La nucleoproteína ciclo de infección viral 35 1. Entrada de las partículas virales 2 . Transcripción, replicación y expresión génica 3 . Procesamiento de los rnas virales y síntesis de proteínas 4 . Formación y salida de nuevas partículas virales procesos de replicación y transcripción del virus de la gripe 38 1. Transcripción viral 2 . Replicación viral factores celulares asociados a las rnps 40 estudio estructural de maquinarias de replicación 41 1. Abordajes tridimensionales 2 . Requerimientos 3 . De la observación al microscopio a la obtención de un m odelo 3d – el procesamiento de la imagen – a nálisis bidimensional – r econstrucción tridimensional de partículas in dividuales objetivos 47 materiales y métodos 51 materiales 53 1 . Líneas celulares 2 . Bacterias 3 . Virus 4 . Plásmidos 5 . Anticuerpos 6 . Resinas de cromatografía métodos 53 manipulación del dna y clonajes 1. Construcción del plásmido pcmv cmv pb pb 2-his is 2 . Construcción del plásmido phh clon 23 3 . Mutantes de np np generación y titulación de vtf7-3 1. Generación de stocks de virus 2 . Titulación mediante ensayo en placa manipulación de cultivos celulares 1. Reconstitución de rnp rnp rnp s in vivo 1.1 para análisis estructural 1.2 para ensayos de complementación 2. Reconstitución de polimerasa in vivo 3 . Expresión de nucleoproteína 4 . Obtención de extractos celulares purificación de rnps paso1. Purificación de rnp rnp rnp s por cromatografía de a finidad p p p aso 2. Purificación de rnp rnp rnp s por cromatografía de e xclusión molecular p p p aso 3. Concentración de rnp rnp rnp s por cromatografía d e afinidad análisis de proteínas 1 . Western blot 2 . Tinción de geles y membranas 3 . Determinación de proteína cat cat cat 4 . Purificación de oligómeros de nucleoproteína por cromatografía de exclusión molecular manipulación del rna 1 . Transcripción in vitro de las rnp rnp rnp s 2 . Digestión controlada del rna rna rna 3 . Marcaje del rna rna rna microscopía 1 . Tinción negativa 2 . Criomicroscopía electrónica 3 . Digitalización y procesamiento de imágenes 4 . Docking resultados 63 determinación de la estructura tridimensional de la rnp recombinante del virus de la gripe 65 1. Generación de rnps recombinantes 1 .1 reconstitución de rnp rnp rnp s 1.1.1 líneas celulares, plásmidos y reactivos de transfección 1.1.2 reconstitución estándar 1 .2 purificación de rnp rnp rnp s 1.2.1 selección y optimización de los métodos y tampones de purificación 1.2.2 purificación estándar 2. Análisis estructural de la rnp recombinante 2 .1 modelo de la rnp rnp rnp por me me de muestras teñidas 2 .2 estructura de la rnp rnp rnp por criomicroscopía electrónica 2 .3 localización de las subunidades en la estructura del complejo de la polimerasa 2 .4 docking de la estructura atómica de la np np en el a nillo de np np 2 .5 estudio de la localización del rna rna rna en la rnp rnp rnp del v irus de la gripe análisis funcional de la rnp del virus de la gripe 76 1. Mutantes de np en la zona de interacción np-np 2 . Mutantes de np en la zona de interacción np -polimerasa análisis estructural y funcional del proceso de transcripción 81 1. Análisis estructural del proceso de transcripción 2 . Análisis genético del proceso de transcripción discusión 89 1. Análisis estructural de la rnp 91 1.1 la estructura de la rnp 1 .2 el anillo de np 1 .3 la posición del rna 1 .4 estructura de la polimerasa y localización d e los dominios de las subunidades 1 .5 resumen final de la estructura de la rnp 2. Nuevo modelo de transcripción viral 97 2.1 estudio del proceso de transcripción 2 .2 ¿puede una rnp silvestre complementar a otra r np defectiva en transcripción? 2 .3¿puede una polimerasa soluble incrementar la tr anscripción de una rnp? 2 .4 nuevo modelo de transcripción viral 2 .5 el nuevo modelo de transcripción en cis en el c ontexto de la infección viral conclusiones 105 bibliografía 109 anexo 131
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio estructural y funcional del arnp del virus de la gripe«
- Título de la tesis: Estudio estructural y funcional del arnp del virus de la gripe
- Autor: Rocio Coloma Ciudad
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 27/10/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- benito Romero Martín
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Juan Antonio Garcia alvarez
- mauricio Garcia mateu (vocal)
- José Antonio Melero fondevilla (vocal)
- María pilar Pérez breña (vocal)