Tesis doctoral de Javier Torres Torronteras
El mngie (encefalomiopatía neurogastrointestinal mitocondrial) es una enfermedad autosómica recesiva asociada con depleción y deleciones múltiples del adn mitocondrial (adnmt), causada por mutaciones en el gen tymp que codifica la timidina fosforilasa (tp). Los pacientes afectos de mngie presentan un cuadro clínico que se caracteriza por dismotilidad gastrointestinal y caquexia, oftalmoplegia externa progresiva, neuropatía periférica, leucoencefalopatía, y evidencias de disfunción mitocondrial. Es una enfermedad crónica cuyos síntomas suelen aparecer en la adolescencia y producen una degeneración progresiva de los pacientes, que tienen una esperanza de vida media de 37 años. la tp es la enzima que inicia el catabolismo de los nucleósidos timidina (thd) y desoxiuridina (durd), que a su vez pueden ser fosforilados a sus formas desoxinucleósido trifosfato mediante la vía de salvamento. Como consecuencia de la disfunción de la tp, en los pacientes de mngie se produce un aumento considerable de la concentración de thd y durd a nivel sistémico. Ello da lugar a un incremento en las concentraciones intracelulares del nucleótido dttp y, como consecuencia, se produce un desequilibrio en la proporción de los cuatro nucleótidos que interfiere con la correcta replicación y mantenimiento del adnmt en células quiescentes. todas las estrategias desarrolladas para el tratamiento del mngie hasta el momento se han dirigido a reducir la concentración sistémica de thd y durd; sin embargo, la única terapia que ha demostrado ser efectiva es el trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos, ya que es capaz de restablecer la actividad tp y reducir la concentración de thd y durd de forma permanente en aquellos pacientes que sobreviven al trasplante. No obstante este tratamiento conlleva unos considerables índices de morbilidad y mortalidad, y los pacientes de mngie son especialmente vulnerables ya que suelen presentar un estado de salud muy deteriorado en el momento de ser tratados. Ello obliga a considerar el desarrollo de terapias alternativas. la terapia génica permite la corrección del defecto genético en algunas células o tejidos de los pacientes, mediante el uso de vectores para introducir una copia funcional del gen afectado. Su aplicación mediante el trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos corregidos genéticamente ha demostrado ser efectivo en el tratamiento de algunas enfermedades, evitando la necesidad de buscar un donante apropiado y reduciendo los riesgos asociados al trasplante alogénico. el hecho de que el mngie sea una enfermedad monogénica, y de que su tratamiento requiera la reducción sistémica de metabolitos sin necesidad de restituir la actividad enzimática a un tejido determinado, hace de esta enfermedad un candidato ideal para la terapia génica. En este trabajo hemos investigado mediante estudios preclínicos la posibilidad de aplicar la terapia génica dirigida al tejido hematopoyético como una alternativa terapéutica para el mngie. para demostrar la viabilidad de esta aproximación construimos un vector lentiviral con las secuencias codificantes del gen tymp y de la proteína verde fluorescente (egfp), bajo el control del promotor de la fosfoglicerato quinasa humana (hpgk), y realizamos estudios preclínicos de corrección génica en un modelo de células linfoblastoides b (b-lcls) provenientes de pacientes de mngie. Asimismo, estudiamos los efectos del trasplante singénico de células progenitoras hematopoyéticas transducidas en un modelo murino de la enfermedad (doble knockout tymp-/- upp1-/-). los resultados obtenidos en el modelo celular demostraron que la transducción con el vector terapéutico es capaz de restituir la actividad tp en b-lcls de pacientes hasta valores por encima de los observados en b-lcls de controles sanos. Los estudios del metabolismo de nucleósidos y nucleótidos demostraron que el restablecimiento de la actividad enzimática permite la degradación del exceso de nucleósidos en el medio de cultivo hasta concentraciones indetectables y no interfiere en el equilibrio intracelular de los nucleósidos trifosfato de las b-lcls. La sobreexpresión de la tp no afectó al ciclo celular de las células transducidas. se estudió la estabilidad de la expresión de la tp en la línea celular inmortalizada humana hek293t y en una línea b-lcl derivada de un paciente. En ambos casos se alcanzaron actividades tp elevadas que se mantuvieron estables a largo plazo, lo que demuestra que nuestro vector es capaz de dirigir la expresión de la proteína funcional de manera estable, y que esta restitución no resulta tóxica. en el modelo animal se puso a punto un protocolo de trasplante singénico de progenitores hematopoyéticos corregidos genéticamente, que consistió en obtener médula ósea de ratones donantes y hacer un enriquecimiento en progenitores hematopoyéticos (lin-). Los progenitores eran transducidos y trasplantados en ratones acondicionados mediante irradiación total corporal a dosis subletales (6 gy), que en experimentos preliminares habíamos demostrado que garantizaba un injerto a largo plazo. el seguimiento de los ratones trasplantados con progenitores hematopoyéticos transducidos con el vector terapéutico demostró que, un mes después del trasplante, había una recuperación de la actividad tp en sangre asociada a una restitución del metabolismo de los nucleósidos que reducía la concentración de thd y durd hasta valores típicos de los ratones salvajes, y se mantuvo así hasta el final del estudio, 6 meses después del trasplante. el análisis del quimerismo en médula ósea nos permitió determinar que el tratamiento era efectivo con un bajo porcentaje de células de médula ósea corregidas genéticamente, que oscilaba entre el 5 y el 28%. Los contajes diferenciales de los diferentes tipos celulares en sangre periférica eran normales. Además, se observó que los progenitores transducidos daban lugar a células maduras de los linajes mieloide y linfoide. en conclusión, el vector lentiviral con la región codificante del gen tymp es capaz de transducir y expresar de forma estable la tp dando lugar al restablecimiento de la actividad tp, lo que permite la normalización del metabolismo de los nucleósidos in vitro e in vivo. La expresión génica a partir del vector lentiviral no afecta a la viabilidad de las células transducidas ni a la diferenciación del tejido hematopoyético. Además, el tratamiento es efectivo en ratones a bajos niveles de quimerismo molecular, lo cual permite reducir las dosis de vectores lentivirales para la transducción, así como el grado de mieloablación necesario para el trasplante. Este trabajo demuestra que la terapia génica basada en células madre hematopoyéticas para el mngie es viable y que esta enfermedad presenta una serie de ventajas para una futura aplicación de esta alternativa terapéutica, aunque son necesarios más estudios que pongan de manifiesto su eficacia y seguridad a largo plazo.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudios preclínicos de la terapia génica basada en células madre hematopoyéticas para el mngie«
- Título de la tesis: Estudios preclínicos de la terapia génica basada en células madre hematopoyéticas para el mngie
- Autor: Javier Torres Torronteras
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 05/05/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ramón Martí Seves
- Tribunal
- Presidente del tribunal: joan xavier Comella carnice
- Juan Antonio Bueren roncero (vocal)
- (vocal)
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