Tesis doctoral de Paula Cardenas Mastrascusa
Recn purificada de bacillus subtilis con un 98% de pureza parece poseer una actividad exonucleasa en adn de cadena sencilla (adncs), con polaridad 3¿¿5¿ dependiente de mn2+. En este trabajo se encontró que la enzima polinucleótido fosforilasa (pnpasa), encargada de regular el metabolismo de arn, y que se encontraba presente en aproximadamente un 0.2% de la muestra de recn purificada, era la responsable de tal actividad. Cuando recn era purificada de células con una mutación nula en el gen pnpa (¿pnpa, codificante para pnpasa) la actividad nucleasa desaparecía. Sin embargo, el mismo patrón de degradación se obtenía cuando pnpasa purificada se agregaba a la preparacion de recn purificada de células ¿pnpa. en el presente trabajo se demuestra que pnpasa es capaz de degradar adncs en presencia de mn2+ y de bajas concentraciones de fosfato inorgánico (pi). El procesamiento de adncs llevado a cabo por pnpasa es distributivo, se encuentra regulado por la presencia de atp ó datp, y es inhibido por la presencia de mg2+ ó de niveles altos de pi (< 100 ¿m). Por el contrario, pnpasa puede degradar arn en presencia de mg2+ y niveles altos de pi (10 - 30 mm), lo que sugiere que las actividades degradativas llevadas a cabo por pnpasa en arn y en adncs, ocurren por mecanismos mutualmente exclusivos. además, en este estudio se demostró in vitro que en presencia de mn2+ pnpasa tambien era capaz de polimerizar sin necesidad de molde en los extremos 3¿-oh de un adncs empleando dndps. Como estos resultados se obtuvieron después de 5 décadas de investigación en esta enzima, se pensó que podían ser algo exclusivo de b. Subtilis. Para comprobar lo anterior se purificó pnpasa de escherichia coli, como representante de un género evolutivamente distante, y se encontró que las actividades nucleasa y polimerasa estaban muy conservadas en ambos géneros de bacterias. También se observó que en ambas enzimas las variaciones en las concentraciones de dndps ó pi podrian estimular la degradación ó polimerización de adncs, mientras que las de (d)atp inhibían ambas actividades. Adicionalmente se encontró que las proteínas recn y reca, podían modular las actividades de la enzima pnpasa, a través de la estimulación de la reacción de polimerización ó la de degradación, respectivamente. análisis genéticos demostraron que las células con una mutación nula en pnpa (¿pnpa) eran más sensibles al tratamiento con h2o2 al compararlas con la cepa wt. también se encontró que la mutación ¿pnpa no era epistática con ¿reca, ni con funciones que procesan los extremos a los que se une reca (adda, ¿recj), ni tampoco con funciones que procesan los intermediarios de recombinación catalizados por reca (¿recu, ¿recg); sin embargo, la mutación ¿pnpa sí era epistática con ¿recn y con ¿ku. Lo anterior parece indicar que pnpasa estaría involucrada en la fase temprana de reparación de rupturas de doble cadena (rdc) antes de que se decida la vía de reparación, ya sea por recombinación homóloga (rh), ó por unión de extremos no homólogos (uenh). Estudios de microscopía de fluorescencia, indican que pnpasa debe ser una de las primeras proteínas en unirse a los extremos de adncs, ya que era necesaria para la formación adecuada de un único foco de recn (primera proteína que reconoce el lugar del daño) por nucleoide luego de la inducción de rdc. los datos presentados en éste trabajo indican que pnpasa estaría involucrada en diversas vías del metabolismo de los ácidos nucleicos. Los resultados obtenidos sugieren que en ausencia de rh, la actividad degradativa de pnpasa puede estar contribuyendo a la reparación de la rdc, mediante la generación del sustrato necesario para la unión de la proteína ku vía uenh.
Datos académicos de la tesis doctoral «Role of polynucleotide phosphorylase during double-strand break recognition in b. subtilis.«
- Título de la tesis: Role of polynucleotide phosphorylase during double-strand break recognition in b. subtilis.
- Autor: Paula Cardenas Mastrascusa
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 25/11/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Juan Carlos Alonso Navarro
- Tribunal
- Presidente del tribunal: andrés Aguilera lópez
- José Berenguer Carlos (vocal)
- humberto Sanchez gonzalez (vocal)
- José félix Prado velasco (vocal)