Tesis doctoral de Miren Zumarraga Uribesalgo
Actualmente, la evolución molecular dirigida se presenta como la estrategia más adecuada para la ingeniería de enzimas en ausencia de suficiente información estructural. Se trata de una efectiva herramienta que está revolucionando la biotecnología, permitiendo la mejora de propiedades enzimáticas y el diseño de nuevas funciones nunca antes requeridas en ambientes naturales. Esta metodología recrea en el laboratorio los procesos claves de la evolución natural(mutación, recombinación y selección) de manera que es posible diseñar enzimas de gran interés científico y tecnológico comprimiendo la escala temporal de la evolución natural desde millones de años a tan sólo meses o incluso semanas. En la evolución artificial o dirigida, es el investigador quien escoge la presión selectiva a la que va a ser sometida la proteína (ej. Altas temperaturas, presencia de disolventes, nuevas actividades o especificidades, resistencia a phs extremos, etc) lo que permite delimitar rutas evolutivas muy concretas. Para ser exactos, los científicos emulan la variedad mediante mutaciones inducidas y/o recombinaciones en el material genético que codifica para determinadas proteínas. A continuación se escogen los mejores clones de la generación creada, y se utilizan como parentales en un siguiente ciclo de evolución repitiendo el proceso varias veces para potencias exponencialmente la propiedad que se quiera mejorar. las lacasas (ec 1.10.3.2, bencenodiol; oxígeno oxidorreductasas) son metaloenzimas que catalizan la oxidación de una gran variedad de sustratos fenólicos (orto y para difenoles, polifenoles, fenoles sustituidos); aminas aromáticas e incluso algunos elementos y complejos inorgánicos (mn2+,12. Fe(edta)2-), acopiada a la reducción del oxígeno molecular a agua. Entre otras aplicaciones biotecnológicas, las lacasas se emplean en la biorremediación de diversos compuestos tóxicos, el procesado de la lignocelulosa en la industria papelera o en síntesis química. La mayoría de estas biotransformaciones se deben llevar a cabo en elevadas concentraciones de disolventes orgánicos, lo cual puede disminuir la estabilidad de la enzima provocando su desnaturalización e inactivación. en la presente tesis doctoral se ha evolucionado la lacasa termoestable del ascomicete myceliophthora thermophila hacia su actividad y estabilidad en presencia de disolventes orgánicos. El producto genético de cinco ciclos de evolución dirigida expresado en saccharomyces cerevisiae, la lacasa r2, toleró concentraciones superiores al 50% (v/v) de un amplio número cosolventes miscibles en agua de relevancia biotecnológica. Las características intrínsecas electroquímicas de la lacasa como el potencial redox de los sitios t1 y t2/t3 y la estructura geométrica y electrónica de los cobres catalíticos se vieron alteradas en el transcurso de los experimentos de evolución in vitro. Algunas de las mutaciones se localizaron en la superficie de la proteina estableciendo nuevos puentes de hidrógeno y pares salinos que contribuyeron a una mayor estabilidad de la estructura proteica en diferentes regiones propensas a la desnaturalización. Además, las mutaciones introducidas en la extensión c-terminal afectaron al plegamiento de la proteína en los estadios de maduración post-traduccionales. por otra parte, se ha desarrollado una nueva metodología llamada in vivo overlap extensión (ivoe, extensión por solapamiento in vivo) que se basa en la elevada frecuencia de recombinación homóloga de saccharomyces cerevisiae. Esta herramienta proporciona una alternativa in vivo, rápida y eficaz para la construcción de librerías de mutagenesis saturada combinatorial evitando reacciones de pcr adicionales, formación de sub-productos y los pasos de ligación in vitro. Mediante la técnica de mutagenesis saturada, donde un único codón que codifica para un determinado aminoácido de interés es mutado por todos los codones que codifican los 20 aminoácidos naturales, se logra expandir el número de sustituciones aminoacídicas accesibles por mutagenesis aleatoria. Además, también puede utilizarse par mutagenizar simultáneamente varios codones (mutagenesis saturada combinatorial) tanto en bloques contiguos como en posiciones separadas. De esta forma se exploran todas las posibles combinaciones y permutaciones de aminoácidos de interés para identificar sus óptimas interacciones y sinergias en el estudio las propiedades proteicas deseadas. En este trabajo se han realizado diferentes experimentos de mutagenesis saturada combinatorial mediante ivoe sobre residuos clave de la lacasa, aparentemente implicados en la modulación del potencial redox de la enzima. Tras explorar más de 170000 ciones, la mejor variante del estudio, la lacasa 7e1, reveló una relación directa entre el tripéptido altamente conservado 509vsg511, localizado en la proximidad del sitio t1, y la tapa c-terminal.
Datos académicos de la tesis doctoral «Evolucion molecular dirigida de lacasas fungicas en saccharomyces cerevisiae: tolerancia a disolventes organicos y estudios semi-racionales.«
- Título de la tesis: Evolucion molecular dirigida de lacasas fungicas en saccharomyces cerevisiae: tolerancia a disolventes organicos y estudios semi-racionales.
- Autor: Miren Zumarraga Uribesalgo
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 14/09/2007
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Miguel Alcalde Galeote
- Tribunal
- Presidente del tribunal: margarita Salas falgueras
- julio Polaina molina (vocal)
- mario Mencia caballero (vocal)
- María Fernandez lobato (vocal)