Tesis doctoral de Rocío Esquembre Tomé
La inmovilización de compuestos mediante atrapamiento en matrices de sílice sintetizadas mediante el proceso sol-gel ha demostrado su habilidad para albergar especies biológicas y explotar la capacidad de estos biocomposites en aplicaciones analíticas y catalíticas. La bioencapsulación en estos materiales es obtenida principalmente a partir de la hidrólisis y policondensación de precursores alcóxido (generalmente tetraetilortosilicato, teos, o tetrametilortosilicato, tmos), y lleva a la formación de matrices transparentes y altamente porosas en el interior de cuyos poros quedan encerradas las especies biológicas. Este proceso ha sido aplicado principalmente al atropamiento de proteínas solubles o incluso de células completas con un mantenimiento aceptable de la organización molecular y actividad. Sin embargo, este tipo de matrices han sido mucho menos aplicadas a la inmovilización de membranas lipídicas o proteínas de membrana. Es necesario destacar, que la inmovilización de estos sistemas (membranas/proteínas de membrana) permitiría, por ejemplo, el desarrollo de dispositivos de cribado de alto re4ndimiento de moléculas que modulen la actividad de canales o receptores de membrana, tan necesarios en áreas como la síntesis y búsqueda de nuevos fármacos. en este sentido, el objetivo de la presente tesis ha sido la inmovilización y caracterización de membranas y proteínas de membrana en vidrios sol-gel utilizando una metodología que minimice los efectos de la encapsulación. En una aproximación bottom-up, inicialmente se diseñaron las condiciones adecuadas para obtener membranas lipídicas estables con el tiempo, como liposomas, encapsuladas en materiales sol-gel que pudiesen posteriormente permitir la inclusión de péptidos y proteínas de membrana. En un estadio inicial, se comprobó el efecto de la utilización de diferentes rutas de inmovilización en la estabilidad de liposomas atrapados compuestos de lípidos aniónicos y zwitteriónicos, los resultados obtenidos evidenciaron la necesidad de utilizar una ruta libre de alcohol. A pesar de la utilización de esta ruta libre de alcohol más biocompatible, el proceso sol-gel de inmovilización ha demostrado afectar a la membrana lipídica, de un modo diferente, dependiendo de la carga de la cabeza polar del lípido. Los efectos de la encapsulación son mínimos sobre los liposomas aniónicos y solamente se observó una ligera disminución del parámetro de orden en la fase gel y un pequeño aumento de la temperatura de transición de fase tras varios días de encapsulación, pero la cooperatividad del proceso se mantiene durante más de 40 días tras la inmovilización. Sin embargo, la encapsulación de liposomas zwitteriónicos afecta a la cooperatividad y fluidez de la membrana lipídica, provocando una distorsión en el empaquetamiento lipídico de la fase gel y una considerable disminución del parámetro de orden y la microviscosidad en fase fluida. Estos resultados apuntan al establecimiento de interacciones electrostáticas entre las cabezas polares de los fosfolípidos zwitteriónicos y la superficie de sílice cargada negativamente de la matriz porosa. en una segunda fase, se ha explorado la capacidad de las matrices sol-gel para inmovilizar el canal iónico gramicidina reconstituidos en liposomas aniónicos y zwitteriónicos, como un modelo simplista de la encapsulación de proteínas de membrana. La inmovilización del sistema aniónico en la matriz de sílice no afectó a las propiedades físicas de la bicapa ni a la actividad del canal gramicidina. Por contra, para el sistema zwitteriónico, la encapsulación altera el empaquetamiento lipídico de la membrana y, consecuentemente, sus propiedades físicas pero no modifica la conformación del péptido ni su actividad como canal iónico. Estos resultados sugieren que las proteínas de membrana reconstituidas en liposomas e inmovilizadas en matrices sol-gel de sílice pueden preservar su función incluso en bicapas zwitteriónicas. Finalmente, el canal de potasio kcsa reconstituidos en liposomas, como ejemplo de proteína de membrana de gran tamaño y compleja, ha sido inmovilizado en estas matrices. Tras el atropamiento en el sol-gel, kcsa parece mantener su estructura así como su habilidad para seguir sufriendo cambios conformacionales tras el atropamiento (debido a interacciones con iones conductores y bloqueadores, o diferente ph), a pesar de que el empaquetamiento de la bicapa se vea afectado tanto por la incorporación de kcsa como por la encapsulación.
Datos académicos de la tesis doctoral «Las matrices de sílice en la inmovilización de sistemas lipídicos. caracterización y aplicación a canales iónicos reconstituidos en membranas«
- Título de la tesis: Las matrices de sílice en la inmovilización de sistemas lipídicos. caracterización y aplicación a canales iónicos reconstituidos en membranas
- Autor: Rocío Esquembre Tomé
- Universidad: Miguel hernández de elche
- Fecha de lectura de la tesis: 17/06/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Carmen Reyes Mateo
- Tribunal
- Presidente del tribunal: marisela Velez tirado
- Ana isabel Abrantes coutinho (vocal)
- Francisco Rafael Montilla jiménez (vocal)
- María Luisa Ferrer pla (vocal)