Tesis doctoral de Miguel Angel Brieño Enriquez
Introducción: la gametogénesis es el proceso de formación, desarrollo y maduración de las células germinales, dentro del cual intervienen una serie de procesos celulares en los que está incluida la meiosis. La producción de los gametos femeninos es un proceso largo y que tiene su inicio durante la vida fetal. Durante este proceso las influencias del medio externo sobre los ovocitos en desarrollo se vera reflejada en la edad reproductiva. Estos efectos pueden ser una baja reserva ovárica así como infertilidad y mayor riesgo de aneuploidías. Múltiples agentes exógenos han sido relacionados a estos defectos, pero sin duda unos de los que actualmente es objeto de investigación son los disruptores hormonales. Los disruptores hormonales tienen efecto sobre el sistema endocrino mimetizando hormonas o como antagonistas. El bisfenol a (bpa) es un disruptor hormonal, que mimetiza el efecto de hormonas estrogénicas; sus efectos en animales de experimentación han sido impactantes por los efectos a nivel de fertilidad en individuos del género masculino como femenino. Esta sustancia la podríamos considerar omnipresente, ya que se encuentra en todos los recubrimientos de latas de conservas, refrescos, alimentos envasados al alto vacío, botellas de agua, resinas de prótesis dentales y un sin fin de objetos de la vida diaria. La comunidad europea tiene legislada desde hace algunos años los niveles máximos de exposición en humano tanto adulto como en niños. Estos niveles de exposición son metabolizados de una manera aparentemente inocua en el ser humano excepto por uno, el feto. El feto al no tener las características del metabolismo hepático adulto se puede acumular el bpa y presente efectos importantes a largo plazo. objetivo: el objetivo de nuestro trabajo es demostrar que este acumulo in utero causar efectos negativos sobre la gametogénesis femenina humana provocando de esta manera gametos anormales que afectaran la fertilidad en el periodo adulto. Para ello empleamos un modelo in vitro que se ha desarrollado en el laboratorio en el cual por medio de disgregación mecánica y suplementación del medio de cultivo hemos obtenido progresión meiótica in vitro mimetizando lo que sucede in vivo. metodología: la metodología a seguir implica las técnicas propias de la citogenética, biología celular y molecular. Se realizó un estudio cualitativo con el máximo número de ovocitos (ovocitos tipo i) posibles, teniendo en cuenta las limitaciones intrínsecas de la muestra analizada. El modelo del estudio será las siguientes características: a) unidad experimental: pozo de cultivo. B) tipo de estudio: experimental, estratificado y balanceado. C) tratamientos: 4 x 7x 2. D) n = 4. Cada disgregado es su propio control, ya que se sembrara en presencia de pba+dmso, dmso y solo con medio de cultivo. Los resultados se expresarán como número de células/estadio: leptoteno, zigoteno, paquiteno. Por otro lado como el número de foci de mlh1 por núcleo en estadio de paquiteno resultados se analizaron un total de 27167 ovocitos. La progresión meiótica se evaluó por número de ovocitos en cada una de las etapas de la primera profase meiótica (leptoteno, zigoteno, paquiteno y ovocitos degenerados) para los diversos tiempos de cultivo y suplemento. La cifra obtenida por etapa se transformó a un valor porcentual que fue analizado y una vez obtenido la homogeneidad de varianzas se realizó el resto del análisis estadístico con un valor de p<0.05. Los estadios de la profase se valoraron en cultivo por medio de inmunofluorescencia, tal como se ha mencionado, y las características del complejo sinaptonémico fueron equivalentes a las observadas in vivo. Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre aquellos grupos tratados con respecto a los no tratados. En el caso de la recombinación los resultados difieren entre los diferentes grupos, habiendo diferencia significativa entre aquellos con control y bpa a dosis elevadas. En estos casos el número de puntos de recombinación se incrementa de manera dramática. conclusiones: 1. El cultivo de ovocitos fetales humanos mediante el uso de métodos de disgregación mecánicos y medio de cultivo enriquecido con factor de crecimiento de células madre, permiten la progresión meiótica de manera sistemática y reproducible. Los ovocitos cultivados bajo estas condiciones tienen tasas menores de degeneración así como mayores porcentajes de ovocitos que alcanzan paquiteno. La recombinación meiótica solo se observa en los ovocitos disgregados con métodos mecánicos y cultivados con medio enriquecido con factor de crecimiento de células madre. 2. Los métodos de disgregación enzimática disminuyen la progresión meiótica de los ovocitos fetales humanos en cultivo e incrementan el número de ovocitos degenerados en todos los tiempos de cultivo. Los ovocitos que se han disgregado con métodos enzimáticos no presentan recombinación meiótica en cultivo. 3. El factor de crecimiento de células madre incrementa la progresión meiótica de los ovocitos fetales en cultivo independientemente del método de disgregación empleado para su cultivo. El factor de crecimiento de células madre disminuye el número de ovocitos que degeneran en cultivo y tiene un efecto de rescate en los ovocitos que se han disgregado con métodos enzimáticos. 4. El bpa y el e2, disminuyen la viabilidad de los ovocitos fetales en cultivo e incrementan la recombinación meiótica. La disminución en la viabilidad de los ovocitos no depende de la dosis ni del tiempo de exposición en el caso de los ovocitos cultivados con bpa. El bpa presenta un umbral de actividad a partir del cual se observa un incremento en la recombinación meiótica en ovocitos fetales cultivados (10¿m). Los ovocitos fetales expuestos a e2 durante su cultivo, no presentan un umbral en relación a la diminución de la viabilidad. En el caso de la recombinación meiótica el efecto observado se asocia a un efecto de dosis respuesta, dependiente del tiempo de exposición y concentración a la que fueron expuestos los ovocitos. De manera particular se observó que el número de puntos de recombinación en el cromosoma 21 se duplico en los ovocitos expuestos a bpa. 5. Los ovocitos fetales humanos en cultivo presentan un patrón de expresión génica que asemeja lo descrito en ovocitos fetales no cultivados en relación a los genes implicados en la cohesión (smc1íY), sinapsis (sycp1), así como la generación (spo11), señalización (rpa y h2ax) y reparación (blm y mlh1) de las rupturas de doble cadena. Los ovocitos fetales cultivados presentan un patrón de expresión génica de los receptores de estrógenos (er¿, eríY y err¿) similar al descrito en ovocitos no cultivados. 6. Los ovocitos fetales humanos en cultivo presentan un patrón de expresión génica que se asemeja a lo descrito para ovocitos fetales humanos no cultivados en relación al gen implicado en la entrada del ovocito a la meiosis (stra8), así como en el gen implicado en la progresión de ovocito a folículo primordial (nalp5). 7. El bpa regula de manera positiva y estadísticamente significativa la expresión de los genes implicados en la generación (spo11), señalización y reparación (rpa y h2ax) de rupturas de doble cadena en ovocitos fetales humanos. La expresión de mlh1 no se encuentra regulada de manera positiva en los ovocitos expuestos a bpa. 8. El bpa regula de manera positiva la expresión génica de los receptores er¿, eríY y err¿. La sobreexpresión de los receptores es estadísticamente significativa en los ovocitos fetales humanos expuestos a bpa.
Datos académicos de la tesis doctoral «Efectos citogeneticos y genicos del bisfenol a en ovocitos humanos en cultivo«
- Título de la tesis: Efectos citogeneticos y genicos del bisfenol a en ovocitos humanos en cultivo
- Autor: Miguel Angel Brieño Enriquez
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 27/05/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Montserrat Garcia Caldés
- Tribunal
- Presidente del tribunal: carme Fuster marqués
- nicolas Olea serrano (vocal)
- (vocal)
- (vocal)