Tesis doctoral de Fernando Valero Cervera
La importancia del estudio del metabolismo de fármacos y xenobióticos, cobra especial relevancia debido a los múltiples factores externos que influyen continuamente sobre el individuo. Por ello el empleo de herramientas farmacológicas capaces de aportar una gran información, con el mínimo efecto sobre el organismo estudiado es fundamental. Desde este punto de vista los estudios realizados en esta memoria corroboran el empleo de la cf como fármaco modelo para el estudio de actividades enzimáticas importantes en el metabolismo de xenobióticos en humanos. La cf permite el estudio de diferentes enzimas como la nat2 (implicada mayoritariamente en procesos de detoxificación), la xo (una importante fuente de radicales libres oxidados) y de varios isoenzimas del sistema multienzimático del citocromo p450, especialmente el p4501a2 implicado directamente en la activación de precursores a compuestos potencialmente tóxicos y cancerígenos, y que es inducible por distintos fármacos y xenobióticos ambientales. Además las distintas vías metabólicas de la cf y de dos de sus principales metabolitos la tb y la tf, permiten también el estudio de otros isoenzimas como el cyp2e1. el conocimiento de todas estas vías metabólicas no es posible sin la realización previa de estudios in vitro, destinados a caracterizar los enzimas implicados en cada una de las distintas etapas. La aproximación en modelos animales presenta como principal ventaja, la fácil obtención de fracciones de tejido y la posibilidad de emplear técnicas de caracterización como inductores y/o inhibidores selectivos, y anticuerpos (boobis y col 1985, 1990). en la presente memoria se realiza en primer lugar la puesta a punto de diferentes técnicas relacionadas con el metabolismo in vitro, como son la inducción de animales de experimentación, la preparación de fracciones microsomales y la optimización de las condiciones necesarias para el desarrollo de reacciones enzimaticas específicas destinadas a su caracterización. Los resultados obtenidos en el primer estudio realizado con microsomas hepáticos de rata previamente inducida com pb o 3mc, empleando como sustrato cf y como inhibidores selectivos quinolonas y furafilina, han ayudado a profundizar en el conocimiento de las vías metabolicas implicadas. El efecto del 3mc, como inductor de los isozimas reguladores de la activación de xenobióticos tóxicos, caracterizado mediante la prueba de la erod y comparada con la de la cafnd, frente al efecto producido por el pb como inductor de otras formas enzimáticas, indicaron la implicación del entonces llamado citocromo p448 en la principal vía metabólica de la cf, su n3-desmetilación a px. la dificultad de extrapolar los resultados obtenidos en animales a la especie humana, recomendaba continuar el estudio in vitro en preparaciones hepáticas humanas, cuyo metabolismo es difícilmente manipulable, dado la imposibilidad de administrar inductores o inhibidores empleados en el laboratorio a la población. Por ello se realiza un ensayo empleando microsomas hepáticos humanos, previamente caracterizados mediante pruebas enzimáticas específicas, y cuyo resultado indicaba una actividad enzimática elevada. El estudio ser realizó empleando como inhibidores selectivos la quinidina, el ketoconazol y la furafilina, y conllevó la puesta apunto de un método de análisis por cromatografía líquida de alta eficacia. Los resultados, indicaban la implicación exclusiva del isoenzima p4501a2 en la n3-desmetilación de la cf, la vía principal en humanos., Y en la n7 -desmetilación de la px a 1x. los resultados de los dos estudios anteriores, permitían definir las vías enzimáticas principales del metabolismo de la cf con implicaciones relevantes en farmacología. La consecuencia lógica era aplicar los conocimientos adquiridos, junto a la información bibliográfica existente a la realización de un estudio poblacional, que finalmente se llevaría a cabo con voluntarios sanos y con enfermos en cuyo cuadro clínico aparecían hepatopatías y la posibilidad de alteraciones enzimáticas, por activación o por inhibición de vías metabólicas. la posibilidad de obtener con una misma prueba y dos análisis cromatográficos paralelos, información relativa a tres vías metabólicas: citocromo p4501a2, nat2 y xo, mediante la administración de un fármaco como la cf ampliamente distribuido en la población como parte de la dieta habitual, permitía realizar el estudio con un gran número de población, previamente caracterizada. para llevar a cabo el estudio se preparó un protocolo clínico de administración del sustrato cf, a una población previamente caracterizada. Se controló todo el proceso desde la dosificación de la cf hasta la recogida y conservación de la muestras. Además la necesidad de cuantificar principalmente los metabolitos más polares de la cf, obligó a la puesta a punto de dos métodos analíticos de cromatografía líquida de alta eficacia, uno empleando fase reversa y otro empleando cromatografía de exclusión, con la dificultad adicional de separar estos compuestos de la mayoría de los productos de excrección del organismo humano que presentan características principalmente polares. mediante el estudio de estos enzimas, se conseguía determinar el fenotipo oxidativo, el fenotipo acetilador y la actividad xo. La determinación del fenotipo oxidativo en un grupo poblacional, permite establecer dos subgrupos. El formado por individuos con fenotipo rápido, presenta gran facilidad para oxidar diversos sustratos tanto endógenos como exógenos. Una oxidación rápida y enérgica ocasiona en determinadas condiciones la formación de compuestos tóxicos a veces por la aparición de radicales capaces de interaccionar con fragmentos de adn, formando aductos implicados en procesos de mutagénesis y carcinogénesis. El estudio del fenotipo oxidativo de un individuo en base a distintas aproximaciones, basadas en relaciones entre las concentraciones de los metabolitos implicados en cada vía, se ha realizado mediante el empleo de cinco cocientes metabólicos: aux/17u, aux/px, (aux+17u+px)/cf, px/cf y (px+17u)/cf. Si bien para todos ellos se encuentran diferencias estadísticamente significativas entre población afectada y control, con valores más elevados para la primera, no es posible establecer discriminación entre los diferentes subgrupos en dos cocientes el (aux+17u+px)/cf y el (px+cf)/17u, debido a que el efecto de los inductores y el gran número de individuos estudiados, pueden emascarar las antimodas obtenidas mediante representaciones gráficas. El estudio global, apoyado en consideraciones gráficas y estadísticas indica que los cocientes que definen mejor las diferencias entre el grupo poblacional para el fenotipo oxidativo son aux/px y aux/17u, estableciéndose en la población control un 17.8% y 14.6% de individuos lentos, un 77.4% y 78.5% de intermedios y un 4.8% y 6.9% de rápidos respectivamente. Para la población afectada, los porcentajes varían apreciándose un desplazamiento hacia valores altos del cociente, aumentando la proporción de oxidadores rápidos. Así los valores fueron de 1.1% de individuos lentos, 56.1% intermedios y 42.8% rápidos para el cociente aux/px y de 4.3% de individuos lentos, 59.4% intermedios y 36.3% de rápidos para el cociente aux/17u el resultado de este fenotipo viene corroborado por el estudio para todos los cocientes del factor hábito tabáquico, cuya acción, por efecto de los haps del humo, provoca la inducción del isoenzima cyp1a2. para la xantina oxidasa no se encuentran diferencias poblacionales destacadas entre la población control y la afectada para los cocientes 1u/1x y 1u/(1u+1x), dado la escasa preValencia de las deficiencias de este enzima en la población. Empleando el criterio utilizado por otros autores en estudios realizados en la población española sería posible establecer una ligera bimodalidad que indicaría que el 4.1% de la población control y el 3.2% de la afectada serían deficientes de este enzima. Si bien estos resultados son difíciles de asegurar, si se puede indicar que a pesar de que ambos cocientes se encuentran bien correlacionados (r=0.941 en la población control y r=0.903 para la población total), el cociente 1u/(1u+1x) permitiría discriminar mejor entre subgrupos dados su menor diferencia significativa. el estudio del fenotipo acetilador (nat2) se realiza mediante la determinación de los cocientes: aamu/aux, aamu/1x y aamu/(1u+1x). De las tres relaciones metabólicas, la primera, aamu/aux es la que permite establecer mejor las diferencias poblacionales en el grupo de individuos estudiado, apareciendo una distribución trimodal, en la que se encuentran diferencias estadísticamente significativas para el factor enfermedad. Para este cociente se obtienen resultados que indican que en controles el 59.3% de los individuos son acetiladores lentos, el 38.5% acetiladores rápidos heterocigotos y el 3.3% acetiladores rápidos homocigotos, variando la proporción en enfermos a 85.7% de lentos, 14.3% de acetiladores rápidos homocigotos, destacando la ausencia de rápidos homocigotos.Así se observa que los enfermos son mayoritariamente acetiladores lentos, lo cual indica que tienen su capacidad de acetilación disminuida, aumentando su dificultad para eliminar determinados compuestos o sus metabolitos, cuya principal vía de detoxificación es la acetilación. a pesar de que el planteamiento del trabajo no contemplaba inicialmente el estudio de la población con la finalidad de valorar factores asociados a la enfermedad del sat, el conjunto de los estudios realizados indican que la población afectada, padece a nivel global un incremento en su capacidad metabolizadora oxidativa (incrementada en el caso de la población fumadora), y una disminución en su capacidad acetiladora; es decir un incremento en su capacidad para activar xenobióticos tóxicos y una disminución de su capacidad para eliminar los productos del metabolismo. El conjunto de estos dos efectos en un mismo individuo puede llevar a una acumulación de metabolitos tóxicos en el organismo capaces de provocar importantes alteraciones a nivel metabólico. Actualmente la vía de estudio seguida durante esta memoria es una de las principales dentro de los nuevos trabajos que desarrolla el fis sobre el seguimiento de los factores de riesgo asociados al sat, realzando la importancia del estudio del polimorfismo enzimático como un factor poblacional importante en la caracterización clínica de los indivíduos. conclusiones estudios in vitro en animal de experimentación ¿ los estudios in vitro en animal de experimentación indican que la furafilina y diversos antibióticos del grupo de las quinolonas comparten mecanismos de inhibición del metabolismo de la cafeína similares. La n3-desmetilación de la cafeína es la via metabólica implicada. ¿ la n3-desmetilación de la cafeína y la actividad etoxiresorufina-o-desetilasa están fuertemente relacionadas, implicando que el el isoenzima p448 (p450c/p450d) regulaba ambas reacciones metabólicas. ¿ la demostración de la especifidad de la furafilina como inhibidor selectivo del cyp1a2, implica que la n3-desmetilación de la cafeína está regulada por el mismo isoenzima. estudios in vitro en humanos ¿ la n3-desmetilación de la cafeína (cafeína—>paraxantina) y la n7-desmetilación de la paraxantina (paraxantina—>1-metilxantina) están catalizadas exclusivamente por el cyp1a2. Otros isoenzimas (cyp2d6 y cyp3a4) comunes en el metabolismo de xenobióticos no intervienen en dicha reacción metabólica. ¿ en las n-desmetilaciones de teofilina y teobromina están implicados además del cyp1a2 otros isoenzimas del citocromo p450.
Datos académicos de la tesis doctoral «Implicaciones del metabolismo de la cafeína en la activación de xenobiótocos.«
- Título de la tesis: Implicaciones del metabolismo de la cafeína en la activación de xenobiótocos.
- Autor: Fernando Valero Cervera
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 11/03/1997
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Rafael De La Torre Fornell
- Tribunal
- Presidente del tribunal: margarita Arboiz arzo
- Emilio José Sanz alvarez (vocal)
- jordi Cami morell (vocal)
- jordi Camarasa garcia (vocal)