Tesis doctoral de Rafael Frandoloso
Haemophilus parasuis, bacilo gram negativo, es el agente etiológico de la enfermedad de glí¤sser, que se caracteriza por poliserositis, poliartritis y meningitis en el ganado porcino. Se trata de una de las enfermedades emergentes de mayor interés actualidad relacionado con los nuevos métodos de producción intensiva, de alto estatus sanitario, utilizados en esta especie animal. Hasta la fecha, la industria no ha sido capaz de desarrollar vacunas que protejan de la enfermedad producida por cualquiera de los serotipos en los que se dividide esta especie bacteriana, ya que sólo se han observado respuestas eficaces frente al serotipo homólogo. Estos problemas se encuentran directamente relacionados con la variabilidad fenotípica de h. Parasuis y con los escasos conocimientos disponibles acerca de la patogenia de la enfermedad y de la interacción de este microorganismo con el sistema inmune porcino. teniendo en consideración la importancia del hierro en el metabolismo de h. Parasuis, se han desarrollado en esta tesis doctoral, diferentes formulaciones vacunales basadas en proteínas directamente implicadas en la adquisición de este oligoelemento al formar parte del receptor dispuesto en la membrana externa de la bacteria. El estudio de su potencial protector se llevó a cabo en cerdos privados de calostro, con especial énfasis en el análisis de la evolución de las diferentes subpoblaciones de células mononucleares de la sangre periférica, de la expresión de citoquinas y quimioquinas implicadas en las respuestas inmunes innata y adquirida y en el estudio de la interacción in vitro de h. Parasuis con células epiteliales de riñón porcino. previamente hubo de ponerse a punto un protocolo de obtención de cerdos privados de calostro porcino, con el que se logró más de un 90% de supervivencia. Se trabajó en todos los casos con la cepa nagasaki, del serotipo 5 de h. Parasuis, uno de los serotipos considerado más virulentos y referencia habitual de esto. En cuanto a los antígenos vacunales que sirvieron de base para la preparación de las diferentes vacunas, se recurrió a técnicas moleculares para la obtención de un fragmento recombinante de 200 aminoácidos de la proteína tbpa de h. Parasuis (rtbpa), a la vez que se purificó, mediante cromatografía de afinidad, un grupo de proteínas nativas con afinidad por la transferrina porcina (pnatp). Por otra parte, se utilizó un fragmento recombinante de 102 aminoácidos de la proteína tbpb (rtbpb) desarrollada previamente en nuestro laboratorio por del río (2004). Ambas proteínas recombinantes fueron capaces de inducir buenos niveles de anticuerpos policlonales en conejo, los cuales pudieron reconocer las correspondientes proteínas nativas expresadas en la superficie bacteriana. con estos antígenos se desarrollaron cuatro formulaciones vacunales diferentes; las dos 1ª integradas por cada una de las dos proteínas recombinantes, que fueron completadas con un adyuvante a base de aceite comercial montanide ims 2215 vg pr y administradas por vía intramuscular (rtbpa y rtbpb); una tercera compuesta por las pnatp, el mismo adyuvante y la misma vía de inoculación (pnatpim) y una cuarta en la que la administración fue intratraqueal y el antígeno idéntico, pero con un adyuvante constituido de nuevo estaba constituido por la neuraminidasa de clostridium perfringens (pnatpit). Se incluyó además en el estudio una bacterina comercial (porcilis glí¤sser, pg) formulada con el mismo serotipo en el resto de formulaciones antigénicas. los resultados obtenidos de la comparación de las cinco formulaciones vacunales pusieron de manifiesto el efecto protector total (100%) de las identificadas como pnatpim, pnatpit y pg frente al desafío con una dosis letal (de 3í–108 ufc) de la cepa nagasaki de h. Parasuis. Las vacunas rtbpa y rtbpb confirieron únicamente una protección del 33% y 20%, respectivamente, y el grupo de cerdos control, infectados pero no vacunados, desarrollaron los síntomas y lesiones típicos de la enfermedad y murieron durante las primeras 48 horas posteriores a la infección-desafío con una dosis letal de h. Parasuis. el análisis de la respuesta inmune celular desarrollado mediante citometría de flujo (utilizando un panel de anticuerpos monoclonales frente a los antígenos leucocitarios de superficie cd3, cd8a, cd8b, cd4, cd4 naí¯ve, tcrgd, aigm, cd21, cd163, cd172a, sla-drii, cd16 y cd45ra) reveló alteraciones de interés inéditas hasta el momento. Como consecuencia del desafío, los cerdos no inmunizados desarrollaron una linfopenia grave, con un descenso significativo de la población de linfocitos tgd. Se observó un incremento de los linfocitos t citotóxicos y de células nk, además de alteraciones en la expresión de las moléculas de histocompatibilidad de clase ii en los monocitos. Se obtuvieron resultados similares en los animales vacunados con las formulaciones rtbpa y rtbpb que murieron después del desafío. Se observó también una respuesta intensa de linfocitos b (aigm+ cd21+) en los animales bien protegidos frente al desafío, pero no el resto de alteraciones descritas en los grupos experimentales restantes, lo que puso de manifiesto el efecto protector de las vacunas pnatpim, pnatpit y pg. mediante pcr cuantitativa se analizó la expresión de diversas citoquinas y quimioquinas tras el desafío en varios órganos linfoides secundarios (bazo y ganglios traqueobronquiales, mediastínicos y mandibulares) y en los órganos blanco de la infección (pulmón y cerebro); se incluyó además el hígado, debido al carácter invasivo de esta especie bacteriana y por la función que desempeña este órgano en la síntesis de las proteínas de fase aguda. También se utilizó esta técnica molecular para la identificación de h. Parasuis en todas las muestras estudiadas, mediante la cuantificación de la transcripción del gen infb. los resultados obtenidos demostraron que los cerdos no inmunizados y los vacunados con rtbpa o rtbpb transcribían niveles elevados de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias (il-1a, il-1b, tnf-a, il-6, inf-g, il-10, ccl2 e il-8) en todas las muestras, como consecuencia de la infección desarrollada. Sin embargo, los animales protegidos sólo presentaron un incremento significativo en la transcripción de la il-5, lo que justifica la ausencia de un proceso inflamatorio mediado por citoquinas y una respuesta th2, coincidiendo con el aumento de los porcentajes de linfocitos b periféricos y de los folículos germinales de los bazos de los cerdos protegidos. el gen infb permitió el estudio de la distribución de h. Parasuis en las diferentes muestras y se pudo establecer la correlación entre el nivel de transcripción de las citoquinas y quimioquinas proinflamatorias y la presencia o ausencia de h. Parasuis en los órganos. Además, los cerdos no protegidos y mínimamente protegidos presentaban casi un 100% de muestras positivas a este microorganismo, mientras que los animales bien protegidos tan solo presentaban alguna muestra con arnm bacteriano. Las cantidades de arnm encontradas en estos últimos cerdos fueron significativamente menores que las obtenidas a partir de los animales control o vacunados con rtbpa o rtbpb, lo que pone de manifiesto de nuevo la capacidad protectora de las vacunas pnatpim, pnatpit y pg. finalmente, por medio de una infección in vitro, hemos demostrado que h. Parasuis presenta capacidad para adherirse e internalizarse en células de riñón porcino. Este resultado contribuye a la mejor comprensión de la patogenia de la enfermedad de glí¤sser.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudios moleculares e inmunobiológicos de la proteína tbpa (receptor de transferrina) de haemophilus parasuis y de otras proteína de membrana externa con afinidad por la transferrina porcina«
- Título de la tesis: Estudios moleculares e inmunobiológicos de la proteína tbpa (receptor de transferrina) de haemophilus parasuis y de otras proteína de membrana externa con afinidad por la transferrina porcina
- Autor: Rafael Frandoloso
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 04/02/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Cesar Bernardo Gutierrez Martín
- Tribunal
- Presidente del tribunal: lucas Domínguez rodríguez
- Javier Domínguez juncal (vocal)
- mateo Pozo vegas (vocal)
- Juan anselmo Perea remujo (vocal)